17—AAG聯合卡泊芬凈治療中性粒細胞缺乏大鼠侵襲性肺曲霉菌病的效果

戰欣 吳士恒 鄧林

[摘要] 目的 探討Hsp90抑制劑17-烯丙基-17脫甲氧基格爾德霉素（17-AAG）聯合卡泊芬凈（CAS）治療中性粒細胞缺乏的侵襲性曲霉菌病（IPA）的效果。 方法 將40只Wistar雄性大鼠按隨機數字表法分為4組，即A組（空白對照）、B組、C組及D組，每組10只。四組大鼠均用環磷酰胺腹腔注射制備中性粒細胞缺乏模型，再經鼻吸入煙曲霉孢子懸液。A組正常飼養，作為空白對照，B組和C組分別給予1 mg/kg的CAS和1 mg/kg的17-AAG腹腔注射，D組給予17-AAG聯合CAS（用法、用量同上），共用藥10 d。記錄大鼠的生存狀況。檢測治療第3天及第7天大鼠的血清半乳糖甘露醇聚糖抗原（GM），并對肺組織進行GMS染色，觀察感染部位的真菌負荷。 結果 與A組比較，B組及D組生存率均明顯較高（P < 0.01），且D組平均生存時間長于B組，但差異無統計學意義（P > 0.05）。與A組比較，治療第3天各組GM值差異無統計學意義（P > 0.05）；治療第7天，各治療組GM值低于A組（P < 0.01），D組低于B組（P < 0.05）。肺組織切片GMS染色顯示，各治療組真菌感染病灶均減小，且D組減小最為顯著，其治療第15天未發現病灶。 結論 17-AAG可通過抑制應激反應來提高CAS對大鼠IPA的療效。

[關鍵詞] 煙曲霉；卡泊芬凈；17-烯丙基-17脫甲氧基格爾德霉素；中性粒細胞缺乏

[中圖分類號] R519.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（a）-0016-04

Effect of 17-AAG combined with Caspofungin on invasive pulmonary aspergillosis in rats with neutrophil deficiency

ZHAN Xin1 WU Shiheng1 DENG Lin1 ZHANG Hongyue1 GAO Fusheng2▲

1.Clinical Medical School， Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261000， China； 2.Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261000， China

[Abstract] Objective To explore the effects of the combination of Hsp90 inhibitor 17-AAG （17-allyl-17-demethoxygeldanamycin） and Caspofungin （CAS） in the treatmemt of invasive aspergillosis （IPA） with neutrophil deficiency. Methods Forty male Wistar rats were divided into 4 groups， group A， group B， group C and group D， according to random number table method， with 10 rats in each group. Neutrophil deficiency models were made by intraperitoneal injection of Cyclophosphamide in four groups of rats， and then Aspergillus fumigatus spore suspension was inhaled through nose. Group A was fed normally and served as blank control. Group B and C were given CAS of 1 mg/kg and 17-AAG of 1 mg/kg respectively by intraperitoneal injection. Group D was given 17-AAG combined with CAS （the same usage and dosage） for 10 days. The survival status of rats was recorded. The serum galactomannan antigen （GM） was detected on the 3rd and 7th day after treatment， and the lung tissues were stained with GMS to observe the fungal load at the infected sites. Results Compared with group A， the survival rates of group B and group D were significantly increased （P < 0.01）， and the average survival time of group D was longer than that of group B， but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with group A， there was no significant difference in GM values between the groups on the third day of treatment （P > 0.05）. On the 7th day of treatment， the GM values of each treatment group were lower than those of group A （P < 0.01）， while group D was lower than group B （P < 0.05）. GMS staining of lung slices showed that the lesions of fungal infection decreased in all treatment groups， and the most significant reduction was found in group D. No lesions were found on the 15th day of treatment. Conclusion 17-AAG improves the efficacy of CAS in the treatment of IPA by inhibiting stress response.

[Key words] Aspergillus fumigatus； Caspofungin； 17-allyl-17 demethoxygeldemycin； Neutrophil deficiency

侵襲性肺曲霉菌病（IPA）是嚴重的機會性感染性疾病。應用免疫抑制劑以及中性粒細胞缺乏的患者是IPA的高危人群。美國感染病學會推薦伏立康唑作為IPA首選治療藥物。曲霉菌常常對伏立康唑耐藥，臨床常使用卡泊芬凈（CAS）作為補救治療方法[1-4]。CAS通過抑制真菌細胞壁1，3-β-D-葡聚糖的合成，抑制真菌的生長和分裂[5-6]。Cowen等[7]研究發現真菌可通過應激反應減輕抗真菌藥對細胞壁的損傷，推測阻斷細胞應激反應信號通路可能會提高抗真菌藥物的療效[8]。Hsp90是一種高度保守的分子伴侶，它能夠調節細胞穩態和激活多種客戶蛋白并在細胞應激通路中發揮重要的效應，是最常見的調節因子[9]。在無脊椎動物大蠟螟模型中，CAS與Hsp90抑制劑格爾得霉素合用可以使感染煙曲霉的幼蟲存活率顯著提高[9]。但目前尚不清楚其是否在哺乳動物中也有效。為此，本研究制備了中性粒細胞缺乏IPA大鼠模型并給予CAS聯合17-烯丙基-17脫甲氧基格爾德霉素（17-AAG）治療，探討抑制Hsp90聯合CAS治療IPA的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠40只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產許可號：SCXK（魯）20140007，合格證號：0000053]，5～6周齡，體重140～180 g，實驗前1周飼養于濰坊醫學院動物房內，清潔恒溫環境，標準飼料喂養，自由取水。

1.2 試藥

煙曲霉菌株由濰坊醫學院檢驗科提供。水合氯醛（上海國藥集團）、環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）、卡泊芬凈（CAS，上海源葉生物科技有限公司）、17-AAG（medchemexpress公司）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、GMS染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、曲霉菌酶免檢測試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 煙曲霉孢子懸液制備 參考文獻[10-11]的方法，將煙曲霉菌菌株接種于沙氏瓊脂平板培養基上，37℃恒溫條件下培養7 d。用含有0.1%吐溫80的生理鹽水10 mL沖洗培養基表面，收集沖洗液并過濾，將孢子懸液1000 r/min離心10 min，并調整孢子濃度為1×105 cfu/mL。

1.3.2 制備中性粒細胞缺乏侵襲性煙曲霉感染大鼠模型 所有大鼠煙曲霉接種前4 d及接種前1 d腹腔注射環磷酰胺75 mg/kg，接種前1 d及接種后第4天采用血球計數板計數中性粒細胞均<200×106/L，中性粒細胞缺乏IPA大鼠模型制備成功。造模成功后參考Havaux和Denis的方法[12-13]，腹腔注射給予10%的水合氯醛0.3 mL/100 g，麻醉大鼠，每側鼻孔各緩慢滴入50 μL煙曲霉孢子懸液。

1.3.3 分組 采用隨機數字表法將40只Wistar雄性大鼠分為4組，每組各10只：A組（空白對照）正常飼養，B組腹腔注射給予1 mg/kg CAS，C組腹腔注射給予1 mg/kg 17-AAG，D組腹腔注射給予17-AAG + CAS（用法、用量同上），均為1次/d，共治療10 d。

1.3.4 動物標本處理 接種真菌后第3天及第7天，將大鼠麻醉后固定，經內眥靜脈收集血液，3000 r/min離心10 min，留取血清，采用ELISA法測定半乳甘露聚糖抗原（GM），評估其中的真菌負荷，按說明書操作并根據試劑盒提供的標準閾值血清及換算公式計算出被檢血清的GM值。GM值=被檢樣品血清OD值/標準品血清OD值均值，GM<1為陰性，GM>1.5為陽性，1

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，繪制Kaplan-Meier生存曲線，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用q檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，用log秩檢驗評估大鼠存活率的差異；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

接受環磷酰胺免疫抑制后第2天，大鼠出現精神狀態不佳，飲食及活動減少，毛色灰黃。經鼻接種煙曲霉孢子懸液后，大鼠以上表現加劇，且出現眶周、鼻周帶血。治療7 d后，各組大鼠一般情況略有好轉，食欲增加，呼吸平穩，生存時間延長。

2.2 大鼠生存期觀察

A組大鼠均在煙曲霉滴鼻后第3天至第8天死亡。與A組比較，C組存活率未提高（P = 0.27），B、D組存活率均在15 d后達到20%（P < 0.01）。其中，D組平均生存時間[（9.80±1.20）d]>B組[（8.8±1.06）d]>C組[（5.6±0.64）d]>A組[（4.7±0.52）d]，中位數平均生存時間D組（8 d）=B組（8 d）>C組（5 d）>A組（4 d）；與B組比較，D組大鼠的存活率沒有提高（P = 0.54），但D組大鼠平均生存時間延長。見圖1。

2.3 GM試驗

接種煙曲霉后第3天，各治療組血清GM值差異無統計學意義（P > 0.05）。接種后第7天，各組大鼠血清GM值均低于A組（P < 0.01），提示隨著治療時間的延長，對大鼠的治療效果逐漸明顯；與治療前比較，B、D組其療效呈時間依賴性的趨勢（P < 0.05），其中D組的GM值明顯低于B組（P < 0.05），提示聯合17-AAG可顯著提高CAS的治療效果。

2.4 肺組織GMS染色

本研究應用GMS染色顯示大鼠肺內的煙曲霉菌絲。GMS染色下真菌孢子呈明顯的黑褐色。煙曲霉滴鼻后第3、4天，各組均可發現煙曲霉菌絲，但在真菌負荷方面沒有明顯差異。曲霉滴鼻后第6、7天，各組肺組織發現真菌菌絲明顯增多，肺部感染嚴重。其中，D組菌絲少于其他各組。觀察至接種后第15天，僅B、D組有大鼠存活，B組有微量的煙曲霉感染灶，D組未發現煙曲霉感染。見圖2。

3 討論

IPA是一種由曲霉菌引起的疾病，極易危及免疫缺陷患者的生命安全[14-15]。由于IPA發病率和死亡率的增加及抗真菌藥物選擇的局限性，亟待開發新的IPA治療方法或藥物。近年來，抗癌藥物Hsp90抑制劑作為新的抗真菌治療靶點引起了人們的興趣[16]。Hsp90為一組進化上高度保守的蛋白，在應激條件下觸發適應性反應而發揮作用[17]。抑制真菌分子伴侶Hsp90的功能可以使耐藥病原菌對抗真菌藥物反應更快，并能阻止其耐藥性的產生[8]。CAS通過抑制真菌細胞壁1，3-β-D-葡聚糖的合成而對真菌產生抑菌作用，細胞壁完整性的喪失誘發了真菌的急性應激反應[7]，Hsp90在其中起了關鍵作用[18-20]。由此推斷，抑制Hsp90在應激狀態下的功能可以更好地發揮CAS的抗真菌作用。為此，本研究制備了中性粒細胞缺乏IPA模型大鼠，探討抑制應激反應對CAS治療大鼠IPA的效果影響。

本研究結果顯示，各治療組經治療后病情都有緩解，其中聯合用藥效果最為顯著，且與CAS單藥治療比較，其平均生存時間延長。通過測定血清GM值顯示，與CAS單藥治療比較，聯合用藥GM值降低，差異有統計學意義（P < 0.05），提示聯合用藥治療更為有效。同時本研究對大鼠肺組織的病理學檢測也顯示對照組、CAS組、17-AAG組的煙曲霉負荷高于聯合用藥組，提示了兩種藥物具有協同作用，抗真菌效果更強。

總之，17-AAG可以通過抑制應激反應提高CAS對大鼠IPA的療效，提示Hsp90抑制劑與抗真菌藥物的聯合可能為提高抗真菌治療效果開辟新的途徑，Hsp90可能成為煙曲霉感染治療的新靶點。

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（收稿日期：2018-08-23 本文編輯：王 蕾）