一種特異性靶向上皮細胞黏附分子EpCAM的小肽的鑒定

朱一超 馬曉雯 何磊

[摘要] 目的 鑒定前期獲得的一個食管腺癌特異性靶向小肽的靶分子。 方法 小肽Pull Down和質譜篩選該小肽的可能靶分子；計算機模擬分子對接、Western blot、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞術、siRNA干擾、基因轉染等方法確認靶分子的正確性。 結果 上皮細胞黏附分子（EpCAM）是該小肽的特異性結合靶分子，且該小肽可特異性結合EpCAM高表達的結腸癌細胞和組織。 結論 除了食管腺癌，該小肽在EpCAM高表達的結腸癌中也具有早期診斷和靶向治療的潛在應用價值。

[關鍵詞] EpCAM；多肽；分子成像；腫瘤靶向治療

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（a）-0004-04

Identification of a small peptide targeting epithelial adhesion molecule EpCAM

ZHU Yichao1 MA Xiaowen2，3 HE Lei2 ZHOU Jiming2，4 PANG Zhijun2 ZHANG Xinlei2 MAO Zhuang1 LI Meng2

1.The Brigade of Undergraduates， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an 710032， China； 2.School of Pharmacy， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an 710032， China； 3.Department of Pharmacology， General Hospital of Ji′nan Military Region， Shandong Province， Ji′nan 250000， China； 4.Department of Cardiology， the 153rd Central Hospital of People′s Liberation Army， He′nan Province， Zhengzhou 450000， China

[Abstract] Objective To find the molecular target of an esophagus adenocarcinoma specific binding peptide （SNF*）. Methods Pull Down and Mass Spectrum were used to identify the potential target； molecular docking， Western blot， laser scanning confocal microscopy， flow cytomertry， RNA interference and gene transfection were used to verify the target of SNF*. Results Epithelial adhesion molecule （EpCAM） was the potential target of SNF*. SNF* specifically bound with EpCAM which overexpressed in colon cancer cells and tissues. Conclusion Except esophagus adenocarcinoma， SNF* can be used in the early diagnosis and targeted therapy in colorectal cancer with high EpCAM expression.

[Key words] EpCAM； Peptide； Molecular imaging； Tumor targeted therapy

利用腫瘤與正常組織的分子表型差異，篩選特異腫瘤組織探針在腫瘤早期診斷和靶向治療中具有重要作用[1-2]。特異性腫瘤組織探針的類型很多，包括抗體、多肽、模擬肽、核酸等[3]。抗體在腫瘤早期診斷和靶向治療中的作用不言而喻，它們可以偶聯放射性核素進行腫瘤早期成像，偶聯抗腫瘤藥物實現靶向治療。然而，抗體的應用存在很多局限性。比如，抗體重鏈容易被網狀內皮系統捕獲，造成肝、脾和骨髓毒性[4-5]；抗體分子大，很難進入實體瘤內部等等。相對于抗體的這些缺陷，靶向性小肽具有分子小、免疫原性低、血漿清除快、腫瘤滲透性高等優點[6]，且小肽生產成本低，更易大規模生產。前期，我們通過噬菌體肽庫篩選獲得了一條能夠特異性結合食管腺癌的七肽（SNFYMPL，SNF*）。該七肽可特異結合早期食管腺癌組織，在食管腺癌早期內鏡診斷和靶向治療中具有潛在用途[7]。然而我們尚不清楚該小肽具體與腫瘤細胞表面什么靶分子結合。本研究中，我們希望鑒定并確認該小肽的靶分子，為該小肽的應用奠定理論基礎，并根據靶分子的表達研究，擴展該小肽的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和組織來源

食管腺癌細胞OE33，結腸癌細胞HT29、SW480、SW620，結腸上皮細胞NCM460均培養于RPMI1640。巴雷特食管上皮細胞Q-hTERT培養于角質細胞無血清培養基（Life Technologies）。結腸癌以及癌旁組織取自空軍軍醫大學唐都醫院，患者知情同意。本研究方案通過空軍軍醫大學倫理委員會批準。

1.2 多肽Pull Down

SNF*偶聯于EAH Sepharose 4B（GE Healthcare）。對照多肽GGGSK以同樣方式偶聯，制備SNF*-EAH和GGG*-EAH凝膠柱。OE33和Q-hTERT細胞裂解（pH 7.5，1% Triton X-100）后上柱（1 mg/mL），4℃過夜，1 mol/L NaCl洗脫，SDS-PAGE電泳分離，硝酸銀染色。部分洗脫液電泳后，進行Western blot鑒定。

1.3 計算機模擬分子對接

RCSB PDB蛋白數據庫獲得EpCAM晶體結構（PDB ID：4MZV）。Discovery Studio 3.5軟件進行SNF*與EpCAM的模擬對接。

1.4 siRNA干擾和EpCAM基因轉染

EpCAM干擾序列如下，siRNA1：5′-GCCGUAA-ACUGCUUUGUGATT-3′，5′-UCACAAAGCAGUUUA-CGGCTT-3′；siRNA2：5′-GACAAGGACACUGAAAU-AATT-3′，5′-UUAUUUCAGUGUCCUUGUCTT-3′；對照序列為：5′-CUAGCUAGGTTUCCAUTCCTT-3′，5′-AUCGCCUTTCGGUAUAUTCTT-3′。轉染試劑為Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）。EpCAM的DNA編碼區由上海吉瑪公司合成，轉染質粒為pcDNA3.1。突變型EpCAM序列是將預測的SNF*結合位點刪除的序列，轉染步驟同上。

1.5 實時定量PCR

TRIzol試劑提取總mRNA，采用iTaq Universal SYBR Green Supermix法在qRT-PCR儀上進行實時定量分析。EpCAM引物如下：5′-ATAACCTGCTCTGAGCGAGTG-3′；5′-TGCAGTCCGCAAACTTTTACTA-3′，β-actin為內參。

1.6 激光共聚焦顯微鏡

細胞培養于4孔細胞培養載玻片，待生長至80%滿時，血清封閉，PBS清洗，SNF*-FITC多肽（0.5 mmol/L）孵育1 min。洗滌后多聚甲醛固定，DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡（Fv1000，OLYMPUS）觀察。Cy3-EpCAM抗體染色時，細胞先進行固定和封閉，4℃孵育過夜。

1.7 流式細胞術

細胞胰酶消化分離，20%山羊血清封閉，0.1 mmol/L SNF*-FITC 4℃孵育40 min，甲醛固定，PBS洗滌，流式細胞儀（FACSCalibur，Beckton Dickinson）分析，Flowjo軟件作圖。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0對所得數據進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNF*靶分子的鑒定與驗證

銀染結果顯示OE33與SNF*-EAH孵育后的洗脫液中有一新生條帶（圖1A，方框處）。質譜給出12個可能的候選蛋白。Western blot顯示12個分子中只有EpCAM抗體能夠識別該新生條帶（圖1B）。分子對接顯示SNF*與EpCAM結合如下：絲氨酸與EpCAM的173位Arg形成兩個氫鍵，結合半徑0.27、0.31 nm；絲氨酸與174位Tyr形成氫鍵，結合半徑0.24 nm；天冬氨酸與233位Leu形成氫鍵，結合半徑0.22 nm；甲硫氨酸與241位Asp形成氫鍵，結合半徑0.2 nm（圖1C、D）。

2.2 EpCAM敲減明顯降低SNF*與OE33的結合

EpCAM的siRNA明顯降低EpCAM在OE33的表達（P < 0.01）（圖2A，封三）。激光共聚焦顯示：EpCAM敲減后，SNF*-FITC、Cy3-EpCAM抗體與細胞的結合明顯減弱（P < 0.01）（圖2B～E，封三）。流式細胞術顯示類似結果（圖2F～G，封三）。

2.3 SNF*與EpCAM過表達的Q-hTERT細胞的結合

EpCAM被過表達于Q-hTERT細胞（P < 0.01）。另外，173位Arg、174位Tyr、233位Leu敲除的EpCAM（mEpCAM）也被過表達于Q-hTERT（P < 0.01）（圖3A，封三）。激光共聚焦顯示：SNF*可以識別EpCAM轉染的細胞，而不識別mEpCAM轉染的細胞（P < 0.01）（圖3B～C，封三）。EpCAM單抗（識別位點為第250～314位氨基酸）可明顯結合兩種轉染細胞（圖3D～E，封三）（P < 0.01）。流式細胞術顯示類似結果（圖3F～G，封三）。

2.4 SNF*-FITC與EpCAM高表達的結腸癌細胞和組織特異性結合

Western blot和qRT-PCR顯示與正常結腸上皮細胞NCM460比較，HT29、SW480和SW620高表達EpCAM（P < 0.01）（圖4A，封三）。激光共聚焦顯示：SNF*-FITC特異性結合HT29、SW480和SW620；EpCAM敲除明顯降低SNF*-FITC和Cy3-EpCAM抗體對細胞的結合（P < 0.01）（圖4B～C，封三）。通過免疫組化分析，我們獲得19例EpCAM高表達的結腸癌組織和10例EpCAM低表達的癌旁組織。激光共聚焦顯示相對于癌旁組織，SNF*-FITC和Cy3-EpCAM抗體與腫瘤的結合明顯較高（P < 0.01）（圖5，封三）。

3 討論

EpCAM是單次跨膜糖蛋白[8]，主要參與鈣黏蛋白介導的細胞黏附[9]，并能通過上調c-myc、cyclin A、cyclin E等分子促進細胞周期和細胞增殖[10-11]。EpCAM高表達于包括結直腸癌、食管癌、胰腺癌在內的多種上皮腫瘤[12-13]。歐盟在2013年批準了EpCAM抗體（Catumaxomab）治療結腸癌引發的惡性腹水[14-15]。前期，我們證明SNF*特異性結合食管腺癌組織，能夠在早期食管腺癌的內鏡診斷中發揮重要作用[7]。本研究中，我們證明了SNF*的靶分子是EpCAM，又證明了SNF*可以與EpCAM高表達的結直腸癌細胞和組織特異結合，這大大拓展了SNF*在腫瘤早期診斷中的應用范圍。未來，我們將進行SNF*在早期結直腸癌、胰腺癌的分子診斷及腫瘤藥物靶向遞送方面的研究。另外，小肽最大的問題是體內半衰期太短，過短的半衰期會導致它們在體應用時靶組織的聚集性降低[16-18]。未來，我們還要通過氨基端和羧基端的保護、D型氨基酸替代、PEG大分子保護等方法對該小肽的結構進行優化[19-20]，以便于其更好地應用于腫瘤早期診斷和靶向治療。

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（收稿日期：2018-08-27 本文編輯：張瑜杰）