藏北高寒草地土壤有機質化學組成對土壤CO2排放的影響

馬書琴，魯旭陽

（1.河南師范大學旅游學院，河南 新鄉 453007；2.中國科學院水利部成都山地災害與環境研究所山地表生過程與生態調控重點實驗室，四川 成都 610041）

大氣二氧化碳(CO2)是全球變暖的主要溫室氣體之一，對溫室效應的貢獻率高達60%[1-2]。土壤可通過生態系統呼吸過程向大氣釋放CO2，并受多種因素的影響，比如土壤動物和微生物活性，土壤水分、溫度、有機質、銨態氮(NH4+-N)和硝態氮(NO3--N)含量等[3-5]。其中有機質作為土壤生態系統呼吸的主要碳源和能量來源，其含量的高低和化學組成特征直接關系著微生物代謝底物的多寡和質量[6-7]。草地生態系統作為全球碳循環的重要組成部分，其土壤環境及養分含量與植被類型密切相關。因此，不同類型草地土壤中有機質含量及組成可能通過影響土壤微生物數量和活性，進而影響土壤CO2的排放。

土壤有機質 (soil organic matter, SOM)是植物、微生物和動物殘體在微生物分解及其他物理化學過程中變換而成的復合物質[8]，這種復雜性使得在分子尺度上研究SOM具有一定挑戰性。目前，熱裂解氣相色譜-質譜聯用(pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry, Py-GC/MS)技術被廣泛用于解析森林[9]、草原[10]和農田[11]等生態系統的SOM特征，該方法可以從分子尺度上獲取SOM化學組成“指紋圖譜”[12]。依據Py-GC/MS獲取化合物的來源和相似性SOM主要分為多糖、木質素、蛋白質、酚類、脂肪酸類、烷烴類、芳香類、多環芳烴和萜烯類等物質，這些物質不同程度地影響著土壤微生物活性和土壤碳礦化過程[13]。如，Grandy等[14]研究加利福尼亞森林生態系統發現含氮化合物吡啶和吡咯的相對豐度與真菌和細菌比值呈負相關關系，而木質素衍生物相對豐度與真菌和細菌比值呈正相關關系；White等[15]和Yang等[16]研究北極苔原生態系統發現SOM中易降解成分初級多糖和蛋白質等，可以刺激微生物活性，從而促進自身轉化為CO2。綜上所述，SOM化學組成是影響土壤微生物活性和結構及土壤CO2排放的重要因素。

藏北高寒草地是世界上典型的高寒生態系統和生態脆弱帶，其群落結構簡單、自調節能力較弱，在全球碳循環調控中具有重要作用[17]。該區域由于低溫限制，部分有機質成分被微生物降解利用，不易被微生物分解的成分則貯藏在土壤中，從而SOM在長期的不斷累積和轉化過程中形成了復雜的混合物[18]。關于藏北高寒草地生態系統的SOM化學組成和成分還尚未明確報道。另外，溫度、水分被認為是影響青藏高原草地CO2排放的重要因子，植物凋落物混合物質和動物擾動也通過刺激微生物活性進而影響土壤CO2排放過程[19-20]。近年來研究認為，SOM的含量與土壤CO2排放量存在密切聯系，而且青藏高原地區溫度上升促進了SOM的分解，增加了土壤CO2的排放[21]。然而，SOM中哪些化學成分對土壤CO2排放起關鍵作用還鮮有研究。本研究利用Py-GC/MS方法研究SOM化學組成及其與土壤CO2排放和微生物數量的關系，分析藏北高寒草地土壤中是否存在某些特定的化學成分影響著SOM的生物穩定性以及土壤CO2排放潛力。

1 材料與方法

1.1 研究區域及試驗設計

本研究對象是藏北兩種不同類型草地(高寒草甸和高寒草原)，分別以矮嵩草(Kobresia humilis)和紫花針茅(Stipa purpurea)為主要物種，采樣點集中于西藏那曲市和阿里地區。該區域屬高原亞寒帶氣候區，寒冷干燥，無絕對無霜期。平均年降水量為298～462 mm，一年中大部分降水集中于6-8月。年均氣溫-2.8 ℃，最暖月為7月，月均溫度不及14 ℃，最冷月為1月，月均溫度為-10 ℃以下[22-23]。

在高寒草甸和高寒草原各布設5個樣點，共計10 樣點。在每個樣點選取 3 個 0.5 m × 0.5 m 樣方，用鐵鏟挖取土體表層0-15 cm土壤，混勻后并裝入塑封袋內。土壤樣品分為兩份，一份過0.25 mm篩后風干，用于測定土壤基本理化性質和SOM化學組成；另一份混勻并過2 mm篩后，4 ℃冷藏，用于室內培養測定CO2排放量和磷脂脂肪酸組成。野外采樣于2016年8月完成。

2016年9 月至2017年4月進行室內培養試驗。將相當于100 g干土的鮮土放置250 mL錐形瓶中，并用保鮮膜將瓶口封住后放置于恒溫培養箱中。由于樣品采自不同區域，本研究選擇微生物生長較適宜的溫濕度進行培養，設置每個處理中土壤水分為40%最大田間持水量(Water holding capacity, WHC)，在室內 25 ℃ 培養 210 d，每個處理設置3個重復。土壤CO2氣體的釋放在培養的前14 d，每2 d測定一次；第15天到第49天，每3 d測定一次；第50天到第210天，除特定情況外，約7 d測定一次。每次測定開始前用橡膠塞封住培養瓶口，用真空泵將培養瓶中抽為真空狀態，之后統一通入空氣(空氣為統一購置的干空氣)，并用注射器抽取空氣10 mL測定CO2濃度(w1)，然后在培養箱中恒溫培養2 h后再用注射器抽取培養瓶中土壤上部空間氣體10 mL測定CO2濃度(w2)，w2-w1值為恒溫培養2 h內土壤CO2排放量。氣體樣品在取樣后24 h內用安捷倫氣相色譜儀(Agilent 7890A,Agilent Technologies Inc., USA)測定。

1.2 樣品測定

土壤化學性質采用常規分析法測定[24]。土壤NH4+-N以及NO3--N用流動注射分析儀測定；SOM含量和土壤全氮(TN)采用元素分析儀測定；pH采用酸度計測定；容重采用環刀法測定。用磷脂脂肪酸標記土壤微生物，采用HP6890-HP5973型氣相色譜質譜聯用儀分析氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液提取的磷脂脂肪酸的組成，獲得細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌磷脂脂肪酸標志物的含量[25]。

采用Py-GC/MS方法測定SOM化學組成。將收集的用于測定有機化學成分的土壤樣品置陰涼處自由風干，然后將其研磨成細粉。測定時，稱取磨細后的土壤樣品10～20 mg，利用Pyrofoil包裹，然后利用居里點熱裂解儀對樣品在590 ℃進行高溫裂解。將裂解后產品在線傳送到氣相色譜實驗室，界面溫度 250 ℃，分流比 50 ∶ 1，氦 (He)作為載氣，流速1.0 mL·min-1。裂解產品在氣相色譜柱中進行分離，分離時先在40 ℃保持5 min，然后以5 ℃·min-1速度加熱到 270 ℃，接著以 30 ℃·min-1速度跳躍，使最終溫度保持在300 ℃。將色譜柱分離的產品利用質譜儀進行檢測，EI離子源電壓為70 eV，傳輸線溫度為 270 ℃，離子源溫度為200 ℃[26]。將Py-GC/MS分析獲取的峰利用自動質譜 圖 解 卷 積 鑒 定 系 統 (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, AMDIS 2.72)、質譜庫 (National Institute of Standards and Technology,NIST MS Library 2014)和已發表的相關文獻進行分析和鑒定[27]。鑒定的化學成分利用相對豐度表示其含量大小，相對豐度不能反映出該化學成分在SOM中絕對的豐度，但是能反映出SOM各化學成分的相對組成特征，因此被廣泛用來分析SOM化學成分的相對定量。根據其性質和前體物質以及已發表的眾多文獻信息將SOM化學成分大體歸類為木質素、脂質、多糖、蛋白質、含氮化合物等類別(化學組成)。根據測定的化學成分和確定的化學組成，構建高寒草草甸和高寒草原SOM的“指紋圖譜”。

1.3 數據處理

土壤CO2的累積排放量(cumulative emissions)用以下公式計算[20]：

式中：F是指土壤 CO2的釋放速率 [mg·(kg·h)-1]，i是指第i個土壤樣品，ti+1-ti是指前后兩次土壤CO2釋放測定的時間差，n指總測定次數。

運用 SPSS 20.0(U.S., IBM, 2011)中獨立樣本 T檢驗對兩種草地類型土壤基本性質及化學組成進行差異性比較；利用雙變量相關分析法分析SOM化學組成相對含量與微生物數量及CO2累積排放量之間的相關性。使用 Sigmaplot 10.0(Germany, Systat Software, Inc., 2006)進行作圖。

2 結果

2.1 藏北高寒草地土壤基本性質以及CO2排放特征

高寒草甸土壤SOM、NH4+-N和NO3--N含量顯著(P＜ 0.05)高于高寒草原土壤(表1)。高寒草原土壤容重 (1.44 g·cm-3)與高寒草甸土壤容重 (1.31 g·cm-3)間差異性未達到顯著水平 (P＞ 0.05)。

經過210 d培養后，高寒草甸土壤CO2累積排放量 (1 246.67 mg·kg-1)顯著高于高寒草原土壤(643.15 mg·kg-1) (P＜0.05)。培養期間兩種土壤的 CO2排放通量均未出現明顯波動。高寒草甸土壤在培養過程中的平均 CO2排放通量為 0.23 mg· (kg·h)-1，高寒草原土壤為 0.11 mg·(kg·h)-1(圖 1)。

2.2 藏北高寒草地土壤有機質化學組成

對藏北高寒草甸和高寒草原SOM的Py-GC/MS圖譜和Nist 2014數據庫質譜圖進行比對，并去除無法識別的和僅有一個樣品中出現的化學成分，最終篩選出化學成分(表2)。所有土壤樣品可解析出的化學成分中，含氮化合物種類最多，為23種；其次是脂肪類，為12種；萜烯類和雜環類較少，分別為1和2種。在SOM化學組成中，D-丙氨酸(D-alanine)是主要含氮化合物，其次是吡啶(Pyridine)；芳香類化物的主要裂解產物是甲苯(占SOM化學組成的2.12%～5.38%)；酚(Phenol)(1.20%～4.41%)和2/3-甲基酚(2/3-Methylphenol)是主要的酚類化合物；糖醛(Furfural)是主要多糖類化合物，其中高寒草甸SOM中糖醛所占比例較高，其值大于3%；萘(Naphthalene)是主要的多雜環類(Polyaromatics)；木質素化合物主要為2-甲氧基-4-乙烯基酚(2-Methoxy-4-vinylphenol) (表 2)。

表1 高寒草地生態系統土壤理化性質Table 1 Soil physical and chemistry properties of different ecosystems

圖1 高寒草地土壤培養過程CO2排放通量和累積排放量Figure 1 Soil CO2 fluxes and cumulative emissions during the incubation period

表2 藏北高寒草地土壤有機質Py-GC/MS裂解產物Table 2 List of Py-GC/MS products in the alpine meadow and alpine steppe soil samples

Py-GC/MS圖譜解析結果顯示，高寒草甸和高寒草原SOM中含氮化合物相對豐度高于其他有機成分，占全部化合物的38.0%～52.5%。不過，兩種類型高寒草地土壤含氮化合物的相對含量無顯著差異(P＞ 0.05)；烷烯烴類、多糖類和芳香烴類則表現為高寒草甸土壤顯著(P＜ 0.05)高于高寒草原土壤；脂肪酸類、木質素、多環芳烴類和酚類在兩種類型土壤間無顯著差異 (P＞ 0.05) (圖 2)。

圖2 藏北高寒草甸和高寒草原土壤有機質化學組成相對含量Figure 2 Relative abundance of soil organic matter chemical composition in the alpine meadow and alpine steppe soils

2.3 藏北高寒草地土壤有機質化學組成與CO2排放的關系

相關分析發現(表3)，土壤CO2累積排放量與土壤中含氮化合物、烷烯烴類、脂肪類、木質素類、酚類、多雜環芳香烴類不相關(P＞ 0.05)；而與芳香烴和多糖類相對含量顯著(P＜ 0.05)和極顯著正相關(P＜ 0.01)，其相關系數r分別為0.670和0.800。基于210 d室內培養試驗，建立了關于多糖類與 CO2累積排放量之間關系式，為Y= 86.761X+344.87(R2= 0.632 1,P＜ 0.05)，式中Y為 CO2累積排放量(mg·kg-1)，X為SOM中多糖類物質的相對含量(圖 3)。

表3 土壤有機質化學組成與土壤CO2累積排放量的相關系數Table 3 Correlation analysis between the soil organic matter chemical composition and cumulative CO2 emission

圖3 藏北高寒草地土壤有機質化學組成多糖類相對含量與CO2累積排放量的相關關系Figure 3 Correlation analysis between the soil organic matter chemical composition and cumulative CO2 emission

2.4 藏北高寒草地土壤有機質化學組成與微生物之間關系

芳香烴類和多糖類的相對含量與土壤中磷脂脂肪酸生物標記的細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌含量間顯著(P＜ 0.05)或極顯著正相關(P＜ 0.01)；含氮化合物的相對含量與微生物數量均顯著負相關 (P＜ 0.05)(表 4)。

3 討論

3.1 藏北高寒草地土壤有機質化學組成對CO2釋放的影響

藏北高寒草地生態系統中，SOM含量明顯影響土壤呼吸產生CO2，其中可溶性有機質含量與土壤釋放的CO2存在密切聯系[5, 28]，表明SOM礦化過程中可溶性有機質被優先利用，如可溶性有機氮和可溶性有機碳[18]。Pare和Bedard-haughn[29]研究北極苔原生態系統發現烷類碳和芳香類也顯著影響土壤CO2的排放，這與本研究結果相一致，表明SOM作為藏北高寒草地生態系統土壤CO2是主要來源，除了在含量上影響著CO2的排放，其質量上也與CO2排放存在一定聯系。

不同類型草地SOM化學組成結構的復雜程度的差異直接決定了微生物的利用效率，從而導致土壤CO2排放過程存在差異性。通常認為，土壤微生物較易分解利用蛋白質和多糖類物質，而對結構相對穩定的芳香類化合物的降解能力較低[30-31]。本研究顯示，土壤CO2累積釋放量與多糖類顯著正相關，與含氮化合物顯著負相關，White等[15]和Dai等[32]也得到了類似結果。SOM中多糖的相對含量與CO2排放之間表現為較強相關性可能是由于SOM化學組成中多糖類物質最易降解，其降解速率較快而降解程度較為徹底，為CO2排放提供了主要的碳源物質，進而對預測土壤呼吸具有重要指導作用[15, 33]。

土壤中氮元素含量對CO2動態過程影響的研究大多數集中于無機態氮元素，而土壤中的無機氮素主要來源于微生物對有機氮的礦化作用。因此，土壤中有機氮的含量和質量可能會影響土壤供氮能力進而間接影響土壤CO2的排放。已有研究表明土壤中含氮化合物(有機氮)中不同化學成分錯綜復雜的連接在一起可能抑制土壤中有機氮的降解過程，使得這部分物質在土壤中相對穩定[34]。本研究結果顯示，含氮化合物與CO2排放之間相關性未達到顯著水平，這可能是由于本研究培養時間較短，土壤微生物僅利用了土壤中已有的無機氮，而有機態氮未被分解利用，也可能是含氮化合物存在一定抗性，無法被微生物所降解利用，關于這部分研究可以考慮在未來采用同位素標記方法深入分析。

3.2 藏北高寒草地土壤有機質化學組成對微生物影響

土壤微生物作為草地土壤生態系統的重要組成部分，直接參與并調節著土壤物質循環過程[35-36]。同時，土壤微生物對環境變化較為敏感，其數量、活性、分布特征以及分解有機物質的能力與土壤中有機物質含量和質量密切相關[37]。微生物對SOM的分解是土壤CO2的主要來源，SOM化學組成除了與CO2排放量之間存在直接聯系，可能還影響著土壤中微生物數量。本研究顯示，土壤中細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌數量均與SOM中芳香烴和多糖類物質相對含量密切相關，表明微生物在SOM化學組成中的重要作用。

表4 土壤有機質化學組成與土壤微生物數量的相關系數Table 4 Correlation analysis between the soil organic matter chemical composition and microbial quantity

SOM中多糖含量和質量對土壤呼吸以及形成適宜植物生長的土壤結構具有重要作用[38]，且該物質是最易被微生物所分解和利用的成分[39]。因此，高寒草甸土壤相比高寒草原中的相對較為豐富的多糖類化學成分可能主要來源于微生物，這部分化合物被整合到微團聚體中，最終通過與有機礦物相互作用穩定的保存下來[40]。藏北高寒草地土壤中細菌、真菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌與芳香類化合物呈正相關關系，而與木質素間相關性未達到顯著水平。木質素是在真菌、細菌以及相關微生物共同作用下降解的，真菌占據著主要地位[39]。白腐真菌分泌的酚氧化酶可以將木質素初步降解成為芳香烴化合物，特定的細菌進一步將這些成分礦化成低分子量的化合物[41]。細菌由于其來源廣泛且繁殖速度快，可以在木質素的降解過程中起到輔助作用，如支鏈改性、環開裂和解聚等[42]。因此，藏北高寒草地土壤中木質素可能是作為能源和碳源物質被微生物分解，同時這些微生物可以產生相應降解酶從而將木質素轉化成芳香烴等低分子片段。藏北高寒草地SOM化學組成中含氮化合物負相關于所測定的微生物數量，說明多數有機氮對微生物生長和發育的貢獻要低于其他物質，甚至可能抑制土壤中氮素在各形態之間的相互轉變[12]。

4 結論

本研究基于Py-GC/MS方法分析了藏北高寒草甸和高寒草原SOM本質特征，并探討了不同化學組成對高寒草地土壤微生物數量和土壤CO2排放的影響。研究結果顯示高寒草甸和高寒草原兩種類型草地的SOM化學組成存在明顯差異，而且SOM化學組成中部分化合物的相對含量與土壤呼吸作用存在密切聯系。這從新視角和方法上認識了高寒環境下影響土壤CO2排放的決定性因素，也為研究不同環境條件土壤CO2排放特征提供新的理論依據。