HPLC原子熒光法同時測定辣椒紅中3種辣椒堿類物質(zhì)含量

王繼偉，楊松梅，李佳華，陳艷晶

（云南瑞寶生物科技股份有限公司，云南 昆明 651701）

辣椒紅色素產(chǎn)品中含有的辣椒堿類物質(zhì)包含辣椒堿（capsaicin）、二氫辣椒堿 (dihydrocapsaicin)和降二氫辣椒堿 (nordihydrocapsaicin)等香草酰胺類生物堿混合物[1]。目前，辣椒堿類化合物的測定方法主要有可見分光光度法、FAO紫外雙比色法、高效液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用測定法[6-8]、HPLC-MS/MS法[5]。其中辣椒堿 (capsaicin,C)和二氫辣椒堿 (dihydrocapsaicin,DC)約占總量的90%以上，降二氫辣椒堿 (nordihydrocapsaicin,NDC)7%，高辣椒堿 (homodihydrocapsaicin,HC)1%[2]，這幾種生物堿活性物質(zhì)具有很高的藥用價值，同時被廣泛用于食品添加劑和飼料等領(lǐng)域[3]。

辣椒素含量的高低是評價辣椒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]。因此，檢測辣椒紅中辣椒素含量具有重要意義。上述這些方法存在前處理較為繁瑣、檢測誤差相對較大等問題。基于此，本文通過對樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立較為簡便、快捷、可靠的辣椒素含量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀（配熒光檢測器）；HJ-4多頭磁力攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Molatom1860d純水機(jī)（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；分析天平（METTLER TOLEDO）。

辣椒堿，二氫辣椒堿，降二氫辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度≥98%；甲醇，乙腈，乙酸，均為色譜純；一級水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取一定量的辣椒堿，二氫辣椒堿，降二氫辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別置于10 mL的容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成濃度分別為550mg/L，593mg/L，522mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冷藏保存。

準(zhǔn)確移取一定量的各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10mL的容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成濃度均為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏保存。

工作標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)實際使用濃度進(jìn)行稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品前處理

稱取2g辣椒紅樣品（精確到0.0001g） 置于錐形瓶中，加入100mL甲醇，用磁力攪拌器攪拌提取15min后，將上清液過濾，收集濾液于100mL的容量瓶中，用甲醇定容，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，進(jìn)樣分析。

1.2.3 色譜條件

采用 Sino chrom ODS-BP（4.6mm×250mm，550） 分離；進(jìn)樣量20離；，柱溫30℃；熒光檢測器激發(fā)波長275nm，吸收波長310nm；乙腈-1%乙酸進(jìn)行洗脫，洗脫條件見表1。

表1 洗脫條件Teb.1 Elution requirement

2 試驗方法

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 洗脫條件優(yōu)化

考察了乙腈-1%乙酸的洗脫情況，當(dāng)采用乙腈-1%乙酸（40%～60%）等度洗脫時，組分峰型良好，但分析時間較長；將等度洗脫改為梯度洗脫時，出峰時間提前，樣品的分析時間縮短為20min，故實驗最終采用梯度洗脫作為分析條件。

2.1.2 波長優(yōu)化

對降二氫辣椒堿，辣椒堿，二氫辣椒堿的激發(fā)波長和吸收波長進(jìn)行了比較，最終確定激發(fā)波長為275nm，吸收波長310nm。

本文采用 Sino chrom ODS-BP（4.6mm×250mm，550）作為分析柱，并對進(jìn)樣量，柱溫，流速等參數(shù)做了考察，最終確定了1.2.3色譜條件，3種組分的色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

實驗在參考辣椒堿國標(biāo)測定法的基礎(chǔ)上，考察了甲醇水溶液（30%，50%，70%，90%）和甲醇對辣椒堿的提取效果。實驗得出，甲醇的比例越大，對3個組分的提取效果越好。最終選擇甲醇作為提取劑。

圖1 3種組分標(biāo)準(zhǔn)色譜圖The three Components standard chromatogram

2.2.2 料液比的選擇

比較了 100mL甲醇對 1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4g樣品的提取率。實驗得出，提取率隨著稱樣量增加而增加，當(dāng)稱樣量增到1.8g后，提取率相當(dāng)。故實驗最終選擇1.8g作為最佳稱樣量。

2.2.3 提取時間的選擇

實驗比較了 10min，15min，20min，25min，30min下，辣椒堿等組分的提取情況。發(fā)現(xiàn)，樣品攪拌15min后，提取率沒有顯著增加，因此，選擇提取時間為15min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，配制得系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于自動進(jìn)樣瓶中，上液相色譜進(jìn)行分析，并記錄保留時間及其峰面積，根據(jù)濃度對峰面積繪制得曲線，見表2。

2.4 回收率及精密度

準(zhǔn)確稱取樣品，加入3個水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按1.2.3條件測定。通過實際測定值計算樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表2 3種組分的線性方程及檢出限Teb.2 Linear equation and detection limit of components

表3 樣品加標(biāo)回收率及精密度Teb.3 Standard recovery and precision of sample

2.5 重復(fù)性試驗

分別稱取同一批號辣椒紅產(chǎn)品樣品6份，按照1.2.2樣品前處理方法，平行制備6份供試品溶液，按照1.2.3色譜條件，各進(jìn)樣量20條件，分別測定辣椒堿峰面積為：477016、476852、478421、486098、476851、489154；、二氫辣椒堿 峰 面 積 為 ： 403877、 395874、 405861、405985、400859、406892；降二氫辣椒堿的峰面積 為 ：45802、44965、 46058、45608、46358、46548，其對應(yīng)的RSD分別為1.14%、1.04%、1.24%，結(jié)果表明該含量測定方法具有較好的重復(fù)性。

2.6 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣20h分，按照1.2.3色譜條件分別測定峰面積為：380292、389561、372584、381541、388015、383909；二氫辣椒堿峰面積為 ： 371164、 380587、 364587、 373589、376524、376858；降二氫辣椒堿峰面積為：52688、53791、51858、52515、52944、53131，其對應(yīng)的RSD分別為1.59%、1.49%、1.22%，表明供試品溶液在室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，滿足測定要求。

2.7 樣品測定及方法推廣

實驗測定了6個辣椒紅樣品，含量見表4。將該方法應(yīng)用到飼料辣椒產(chǎn)品中辣椒堿等組分含量測定，結(jié)果表明，該方法精密度好，測定結(jié)果滿足分析要求，詳見表4。

表4 辣椒紅樣品測定結(jié)果Teb.4 Determination of paprika oleoresin samples

3 結(jié)果與討論

本文以色譜柱Sino chrom ODS-BP（4.6mm×250mm，550） 作為分析柱，采用高效液相色譜熒光檢測法分析測定了辣椒紅中辣椒堿，二氫辣椒堿，降二氫辣椒堿的含量。辣椒紅產(chǎn)品中組分加標(biāo)回收率為76.7%～99.5%，精密度為0.2%～10.7%。結(jié)果表明，該方法具有較好的重復(fù)性及良好的穩(wěn)定性，步驟簡單、易操作、檢測時間短、結(jié)果準(zhǔn)確度高，能有效降低分析成本，明顯提高工作效率，為以后分析檢測辣椒紅產(chǎn)品中辣椒素含量提供簡便、高效、準(zhǔn)確的分析方法。