吡格列酮對X線照射后成纖維細胞分泌的基質金屬蛋白酶-9和基質金屬蛋白酶抑制物-1表達的影響

張一思，劉秀麗，潘潔，劉思涵，王文聞

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院腫瘤一科，哈爾濱 150001)

X線放射治療是臨床治療惡性腫瘤的常見手段。射線除了對腫瘤細胞具有殺傷作用，還可能對正常組織有損傷，其中較嚴重的放射性損傷為炎性損傷和纖維化損傷。過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)可以調節糖脂類的代謝及血管的炎性增殖等關鍵蛋白的基因表達，對非放療導致的炎性反應及間質纖維化有抑制作用。但PPAR-γ對放療導致的纖維化損傷及炎性損傷方面尚無太多報道。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)高表達可導致膠原系統破壞及變性膠原纖維增多。TIMPs家族中的組織金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)是組織中MMPs的特異性抑制物之一。TIMPs與MMPs在體內的平衡是保障組織細胞的增殖、凋亡及細胞外基質穩態的重要條件。本文擬觀察正常小鼠L929細胞受到X線照射后分泌的MMP-9和TIMP-1表達的變化，及加入PPAR-γ配體吡格列酮活化L929細胞后對以上因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞獲取及種植 L929細胞購自上海細胞庫(批號：170622)。使用復蘇后第3～10代細胞，細胞密度為2×104/mL。按每孔200 μL接種于96孔板中。每組設5個重復孔。將胰酶加入10 %胎牛血清+1 %青鏈霉素+RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute,洛斯維·帕克紀念研究所)培養液，消化3 min，放入離心機(離心半徑15 cm,轉速1000 r/min)離心5 min，棄上清，加培養液吹打成細胞懸液，移至培養瓶，放入5 % CO2、37 ℃的CO2孵箱。采用RT-PCR法證實L929細胞中是否存在PPAR-γ表達。

1.2 細胞照射及藥物處理 采用X線(劑量率450 cGy/min，10 Gy)于室溫下對L929細胞分別照射。L929細胞生長至90 %融合狀態時更換0.1 %胎牛血清培養基孵育24 h，使細胞不處于增殖狀態，用RT-PCR方法觀察照射前與照射后0 h、2 h、7 h、24 h和48 h時 L929細胞中的MMP-9，TIMP-1的表達情況。再給予上述L929細胞以吡格列酮(北京太洋藥業股份有限公司，批號:161008)，30 μmol/L處理10 h后照射，照射結束后不更換培養基，將細胞送回CO2孵箱，按實驗設計時間收取樣品。用RT-PCR方法觀察照射48 h時L929細胞中的MMP-9，TIMP-1表達。用二甲基亞砜(DMSO)溶解PPAR-γ配體，DMSO終濃度<1‰。

1.3 細胞總RNA提取 處理后的L929細胞去除培養基，PBS沖洗2次置于直徑10 cm培養皿中，加入1 mL Trizol在室溫下輕搖培養皿5 min；再移至離心管中加入200 μL氯仿震動15 s，室溫下放置3 min后離心(離心半徑15 cm,轉速12 000 r/min，4℃)15 min。吸出上層水相移至離心管，再加入0.5 mL異丙醇，充分混勻后于室溫下擱置10 min再離心(離心半徑15 cm,轉速12 000 r/min，4 ℃)10 min，棄上清；RNA沉于管底，用1 mL 75 %乙醇輕輕沖洗后再離心(離心半徑15 cm,轉速8 000 r/min，4 ℃)5 min，棄上清；再加入DMSO的0.9%氯化鈉注射溶液溶解RNA，采用酶標儀A260、A280檢測RNA的純度和濃度。樣本用后至于-80 ℃冰箱長期保存。

1.4 RT-PCR方法 取500 μg的RNA樣品反轉錄成cDNA(complementary DNA，互補DNA)，按逆轉錄試劑盒(TaKaRa:DRR037A)說明書進行規范化操作，于總反應體積10 μL中加入反轉錄酶和引物，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，得到cDNA。PCR擴增：用擴增試劑盒(TaKaRa:DRR003A)中PremixTaq 12.5 mL得到的cDNA 2 μL，上下游引物(20 μM)各0.5 μL，補足滅菌蒸餾水至25 μL。引物序列分別為:PPAR-γ順式5′-TTTTCAAGGGTGCCAGTTC-3′，反式5′AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3′，擴增片斷長198 bp。MMP-9順式5′-TTCACCGGCTAAACCACCTC-3′反式5′-CATGCATGTGAACATAACCTCA-3′擴增片斷長73 bp。TIMP-1順式5′-ACAGACAGCCTTCTGCAACTCPC-3′，反式5′-ACTGCGGTTCTGGGACTTG-3′，擴增片斷長217 bp。GAPDH順式5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，反式5′GGACACATTGGGGGTAGGAACA-3′，擴增片斷長225 bp。反應條件為95 ℃，5 s一個循環，95 ℃，5 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s，30個循環。用3%的瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產物。用凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)分析結果。內參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.5 統計學處理 用SPSS 11.5軟件對不同時點MMP-9、TIMP-1的電泳結果數據進行方差分析，結果有差異后采用LSD法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PPAR-γ表達 RT-PCR的電泳結果顯示，L929細胞中存在PPAR-γ的表達，如圖1所示。

圖1 L929細胞表達PPAR-γ的電泳圖

2.2 單純照射的RT-PCR結果 經X線照射不同時間L929細胞中MMP-9的電泳結果顯示，未經照射(0 h)的L929細胞和經X線照射的L929細胞胞核中都有MMP-9的表達，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一時間點與照射前的MMP-9表達比較，差異均有統計學意義，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一時間點與其后各時間點的MMP-9表達比較，差異均有統計學意義，P均<0.05，而且隨照射后時間的延長其表達逐漸增加，在10 Gy照射后48 h表達最高(F=4.135，P=0.022)，見圖2。X線照射時間對TIMP-1表達的影響規律與MMP-9相反，隨照射后時間的延長TIMP-1表達逐漸減少，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一時間點與照射前的TIMP-1表達比較，差異均有統計學意義，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一時間點與其后各時間點的TIMP-1表達比較，差異均有統計學意義，P均<0.05，在10 Gy照射后48 h TIMP-1表達最低(F=3.646，P=0.041)，見表1和圖3。

表1 不同時點L929細胞中MMP-9、TIMP-1表達的比較

注：MMP-9為基質金屬蛋白酶-9，TIMP-1為基質金屬蛋白酶抑制物-1，下表、圖同；與其照射后各時間點同指標的比較，aP<0.05；與其后各時間點同指標的比較，bP<0.05

注：GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，下圖同

圖2不同劑量X線照射不同時間后L929細胞MMP-9 表達的典型電泳結果

圖3 不同劑量X線照射不同時間后L929細胞TIMP-1表達的典型電泳結果

2.3 加入吡格列酮后RT-PCR結果 照后48 h 用RT-PCR檢測結果顯示，吡格列酮降低了10 Gy照射誘導的MMP-9過度表達[0.76∶0.52 (F=3.735,P=0.024)]。吡格列酮升高了10 Gy照射誘導的TIMP-1過度抑制[0.17∶0.27 (F=3.908,P=0.032)]。見圖4,5。

注：Pio為吡格列酮；DMSO為二甲基亞砜

圖4X線照射后48 h不同處理條件下L929細胞MMP-9表達的典型電泳結果

圖5 不同處理條件下L929細胞TINMP-1表達的典型電泳結果

3 討論

腫瘤放療過程中組織出現的放射損傷在病理學上表現為慢性炎癥和修復共同作用的結果。近年來有研究發現，MMPs與慢性炎性滲出和纖維化關系密切[1-4]。MMPs中MMP-9在多種細胞內具有表達，作用底物廣泛。TIMP-1主要來源于L929細胞、各種腫瘤細胞、單核細胞等，其主要功能為調節細胞粘著，參與細胞外基質的降解與重建。TIMP-1是降解Ⅳ型膠原的主要酶，后者是細胞基膜的主要成分，其損傷可導致細胞膜結構異常通透性增高和炎性介質滲出，最終導致細胞外基質沉積纖維化形成。MMP-9在體內的表達受多種因子的調控，包括特異性及非特異性調控因子。其中TIMP-1即為MMP-9的特異性抑制劑[5-6]。

肺纖維化(PF)的發病機制目前尚未完全明確[7]。目前認為，PF為肺間質性疾病。其病理特點為長期的彌漫性肺泡炎癥和胞外基質的過度沉積。對PF的治療尚缺乏有效、且副作用低的藥物。近年來PPAR-γ在PF中的作用受到學者們越來越多的關注。PPAR-γ屬于有配體激活的Ⅱ核受體超家族，其作用廣泛，除了參與脂質代謝和體內糖平衡外，還參與多種疾病的炎癥和纖維化過程。PPAR-γ具有抗炎抗纖維化作用[8-10]。

關于PPAR-γ在非放射性導致的炎癥和纖維化過程中的作用，現已有不少的報道。已有的研究顯示，PPAR-γ配體可抑制MMP-9的表達，促進TIMP-1的表達。Liu等[11]實驗中采用大鼠肝纖維化模型來考察羥基紅花黃色素A(HSYA)抗肝纖維化的作用機制。其實驗結果顯示，PPAR-γ信號轉導是肝纖維化病程中的關鍵通路，其在H SYA抑制肝纖維化作用機制中系通過促進PPARγ表達、上調TIMP-1蛋白表達而起到預防肝纖維化的作用。周瑾等[12]實驗中考察腎間質L929細胞(NRK-49F)發生表型轉化時的MMP-9及其抑制因子TIMP-1表達的變化。其結果表明，TIMP-1基因蛋白表達水平的上調可減少細胞外基質的降解，從而誘導腎間質L929細胞的活化。周曉霞等[13]研究中應用PPARγ激動劑-曲格列酮或GW9662-PPARγ拮抗劑分別對宮頸癌HeLa細胞進行干預。其結果發現，與空白對照組比較,在干預后的不同時點(0、24 h、48 h和72 h)，激動劑組HeLa細胞的活性隨時間依賴性降低。其中干預48 h后激動劑組的ICAM-1和MMP-9和蛋白表達均明顯降低，而其HeLa細胞PPARγ和蛋白表達和PPARγ 核轉位水平均顯著增加。該研究結果表明，促進PPARγ表達和PPARγ核轉錄水平可下調HeLa 細胞ICAM-1和MMP-9的合成,抑制HeLa細胞的增殖。尹鵬等[14]研究中探討替米沙坦對PPAR-γ及結腸癌SW480細胞TIMP-1表達水平的影響。其結果發現，替米沙坦干預后在不同時點(0、24 h和72 h) SW480細胞活性逐漸降低，而TIMP-1、PPAR-γ和蛋白的表達呈時間依賴性遞增。該結果表明，上調PPAR-γ表達可促進結腸癌細胞TIMP-1的合成和分泌,而導致SW480細胞生長和侵襲能力的降低。王闖[15]研究中探討了肝細胞癌PPARγ/PTEN/MMP-9信號通路的存在及其MMP-9表達水平。其結果發現，經PPARγ配體即15-脫氧-前列腺素J2(15-d-PGJ2)處理后，對肝癌細胞增殖有劑量依賴性的抑制作用，且上調PTEN和蛋白的表達，減少MMP-9和蛋白的表達；而PPARγ抑制劑GW9662可扭轉這一作用。該結果表明，通過PPARγ/PTEN/MMP-9信號通路下調MMP-9表達可抑制肝癌細胞的侵襲和轉移。還有其他學者的研究結果表明，PPAR-γ配體能抑制MMP-9的表達，促進TIMP-1的表達。李春陵等[16]研究中考察丹參酮ⅡA 磺酸鈉對慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道重塑大鼠PPARγ和核因子-κB 表達的作用。其結果顯示，經丹參酮ⅡA 磺酸鈉干預后大鼠血清MMP-9等含量明顯降低，而TIMP-1、TIMP-2表達明顯升高。該結果表明，調節 PPARγ表達可抑制MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子的表達水平。Chuang等[17]考察槲皮素代謝產物qP對細胞侵襲和遷移的作用。其結果可見，qP以劑量依賴的方式可抑制MMPs表達和細胞的侵襲和遷移，而PPAR-γ拮抗劑GW9662可對抗這一作用。該結果表明，對PPARγ的上調作用于MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子從而抑制了細胞的侵襲和遷移。鄒娜等[18]研究中對子癇前期患者胎盤組織中的MMP-2、TIMP-2、PPARγ表達及臨床意義進行考察。其結果可見，MMP-2的表達水平從正常足月妊娠、到輕度子癇前期、再到重度子癇前期呈下降趨勢，而TIMP-2、PPARγ表達水平有升高趨勢。其相關性分析結果顯示，MMP-2與TIMP-2和PPARγ表達呈負相關。該結果表明，子癇前期患者胎盤組織中可見MMP-2表達的下調，而TIMP-2和PPARγ的表達為上調，可見MMP-2、TIMP-2、PPARγ的表達是負相關的。

如上已有的研究結果均提示，MMP-9、TIMP-1表達水平的變化與非放療所致的炎性反應、間質纖維化的進程等有關，而PPAR-γ能夠調節炎性增殖相關的關鍵蛋白的基因表達、從而起到抑制炎癥和組織纖維化的作用。但目前PPAR-γ在放射導致的炎癥和纖維化過程中的作用還少有報道。

本研究中通過添加PPAR-γ配體吡格列酮使其活化后作用于被X線照射后的L929細胞，旨在觀察L929細胞分泌MMP-9，TIMP-1表達的變化情況。本研究結果發現，X射線照射L929細胞后出現纖維化相關因子MMP-9表達升高，TIMP-1表達降低。筆者分析，L929細胞受X線照射48 h后出現了早期炎性反應，故MMP-9表達增高，TIMP-1表達降低。

熊園園[19]考察了2型糖尿病患者血清中TIMP-2、hs-CRP及腎臟NF-κB表達的相關性。其結果發現，治療后NF-κB在吡格列酮組大鼠腎組織中的表達多呈弱陽性，較糖尿病模型組大鼠的表達降低，表明吡格列酮能抑制TIMP-2、NF-κB、hs-CRP等炎性因子的表達，降低血糖,調節機體免疫平衡。劉春麗等[20]考察了吡格列酮對高脂血癥大鼠MMP-2、MMP-9表達的作用。其結果可見吡格列酮組大鼠MMP-2、MMP-9表達水平均顯著下降，表明吡格列酮可抑制MMP-2、MMP-9表達。在本研究中發現，吡格列酮可使MMP-9高表達降低，使TIMP-1低表達升高，本研究結果表明吡格列酮可以抑制MMP-9表達、促進TIMP-1表達。

徐龍[21]研究中對放療所致放射性肺纖維化的發生規律與其分子機制進行了考察。其實驗中建立了雌性C57BL/6小鼠放射性肺纖維化模型，分別于照射后1、3、6個月觀察小鼠肺組織中MMP-9及其抑制劑TIMP-1的表達。其結果可見，照射后小鼠肺組織的MMP-9、TIMP-1表達均顯著性增加,隨時間延長MMP-9增加更明顯。其結果表明，調節肺組織內MMP-9/TIMP-1比例可減輕小鼠放射性肺纖維化的病變程度。在本研究中，將添加PPAR-γ配體的吡格列酮活化后作用于被X線照射后的L929細胞，本研究得到的結果證實TIMP-1為MMP-9的特異性抑制劑、兩者在體內表達水平的相反升降趨勢，本研究結果也表明PPAR-γ配體吡格列酮對成纖維細胞分泌MMP-9，TIMP-1表達的調節作用。本研究得出的結果與如上已有的文獻對于PPAR-γ、MMP-9及TIMP-1的報道均有一定程度的吻合。

綜上所述，X線照射初期使L929細胞分泌MMP-9增多，TIMP-1減少，可能促使炎性因子的急性期滲出，最終促進細胞外基質沉積導致纖維化的形成，而PPAR-γ配體吡格列酮可以抑制這種表達，最終可能抑制X線導致的放射性纖維化的損傷反應。