USP15生物學功能的研究進展

謝 敏，李萬穎，洪曉玲，王淑華，張松靈

(吉林大學第一醫院腫瘤婦科，長春 130021)

泛素是一種在真核生物中高度保守含有76個殘基的多肽,通過一系列酶促反應，其活化的C端可與目的蛋白的賴氨酸ε-氨基結合使其泛素化，也可與另一個泛素的N端α-氨基綴合，形成多聚泛素鏈[1]。蛋白質泛素化修飾是介導細胞內蛋白質選擇性降解的主要路徑，參與蛋白質降解的調節、細胞周期調控、激酶活化及細胞信號轉導等重要細胞內代謝途徑，其主要通過泛素單體或泛素鏈共價修飾目標蛋白發揮作用，是使蛋白質更為有序、多樣的修飾方法[2]。另外，泛素化修飾是可逆反應，其泛素鏈可被泛素特異性蛋白酶剪切，稱為去泛素化，而參與其中的特異性蛋白酶統稱為去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)。DUBs對底物和泛素鏈均具有特異性，使其對目標蛋白的調控更為有序、精確。目前已發現約100個DUBs，可分為6種:泛素C端水解酶家族、卵巢腫瘤相關蛋白酶家族、泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，USP)家族、Josephin結構域蛋白家族、JAB1/MPN/Mov34蛋白酶家族以及最近新發現的單細胞趨化蛋白誘導蛋白家族[3-4]。其中，最具代表性的為USP家族，而USP15是USP家族的重要一員。USP15具有多種生物學功能，現對其基因定位、結構、細胞內功能、免疫功能、病毒、腫瘤的發生發展等方面的研究進展進行綜述。

1 USP15基因定位及結構

人類USP15基因定位于染色體12q14區帶，其蛋白質分子由952個氨基酸組成，分子量約為109 200，由催化區域及非催化區域構成，催化區域含有一個保守半胱氨酸盒和一個組氨酸盒，參與構成USP15的部分活性位點，非催化區域由多個功能子域組成，包括具有特異性結合底物蛋白的泛素特異性蛋白酶域和泛素樣域[5]。人類USP15包含一個N端泛素特異性蛋白酶域-泛素樣域以及一個嵌入在催化域中的泛素樣域，USP15、USP11、USP4這3種蛋白因其N端都具有泛素特異性蛋白酶及泛素樣結構域而被分為一個亞組(泛素特異性蛋白酶域-泛素樣域亞組)，其中，USP4與USP15的結構域同源性高達76%，而USP15與USP11結構域同源性只有39%[6-8]。

2 USP15的細胞內功能

2.1USP15能夠調節轉錄活性 在真核細胞中，組蛋白的翻譯后修飾可以調控染色質的結構及功能，組蛋白H2B單泛素化(ubiquitination of histone H2B，UbH2B)是組蛋白尾中一種保守修飾，其與轉錄、復制及DNA修復有關。Long等[9]研究發現，在轉錄過程中，UbH2B的E3連接酶RNF20/RNF40復合體與RNA聚合酶相關因子復合物結合，RNA聚合酶相關因子復合物直接與RNA聚合酶Ⅱ結合，催化H2B泛素化并刺激轉錄延伸。UbH2B可以通過間接或直接作用參與新生鏈的剪接，在這個過程中，UbH2B從核糖體中游離，使RNA聚合酶Ⅱ能夠繼續識別DNA模板。而USP15能與游離的非核糖體UbH2B結合，使其去泛素化重新裝配于RNA聚合酶Ⅱ延伸后的核糖體上[9]。另外，Fukagai等[10]的研究發現USP15可以參與調節轉錄因子NF-E2相關因子1(NF-E2-related factor 1,Nrf1)的表達。在生理條件下，Nrf1通過調節蛋白酶體基因的表達來維持蛋白質的穩態，其轉錄活性受到內質網的隔離以及兩個獨立的泛素-蛋白酶體通路的抑制，兩個通路包括位于細胞質中的泛素連接酶Hrd1(hydroxym-ethylglutary reductase degradation 1)和細胞核中的泛素連接酶β-TrCP(β-transducin repeat containing protein)。研究結果表明，USP15可通過去泛素化作用穩定并激活細胞核中的Nrf1，且USP15的敲低可減少Nrf1誘導的蛋白酶體的表達，這些結果均提示USP15可通過激活Nrf1的表達，從而在轉錄水平上參與維持蛋白質的穩態[10]。因此，USP15在真核生物的轉錄過程中發揮重要作用。

2.2USP15維持基因穩定性 在真核生物的有絲分裂過程中，染色質的復制與分離需要精確而復雜的調控，其中拓撲異構酶Ⅱ是不可或缺的一部分。拓撲異構酶Ⅱ在有絲分裂的G2期累積，并在前期作用于相互交織的姐妹染色單體，確保其在后期可以精確地平分到子代細胞中。研究發現，拓撲異構酶Ⅱ的積累需要USP15，且USP15的消耗可以導致后期染色體橋的形成，并在有絲分裂出口處形成微核，阻礙姐妹染色單體分離，導致基因的不穩定性[11]。

2.3USP15參與細胞周期過程 沉默轉錄因子RE-1也被稱為神經元限制性沉默因子，是一種重要的生理性抑制性轉錄因子，在神經元分化和細胞周期進程中迅速磷酸化、泛素化和降解。Faronato等[12]研究發現，USP15可調節沉默轉錄因子RE-1的穩定性，沉默轉錄因子RE-1在有絲分裂后急劇降解，然后在G1早期以依賴USP15的方式快速補充。此外，研究還觀察到USP15的表達與細胞周期相關，有絲分裂開始時USP15大量增加并磷酸化，與REST降解一致，隨著沉默轉錄因子RE-1的重新累積，USP15在G1早期去磷酸化[12]。因此，提示USP15可以在細胞周期中表現出時間活性，以促進特定蛋白質的積累。

3 USP15參與免疫反應

3.1USP15調節抗病毒介質Ⅰ型干擾素的生成 病毒進入機體后通過病原體相關分子模式激活免疫反應，其模式識別受體包括Toll樣受體、視黃酸誘導型基因Ⅰ(retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)樣受體和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3[13]。激活的RIG-Ⅰ通過其N端胱天蛋白酶募集結構域招募并激活β干擾素啟動子刺激因子1，通過激活一系列下游信號，最終產生Ⅰ型干擾素和炎性細胞因子等抗病毒介質[14]。Zhang等[15]的研究表明，USP15的特異性催化作用使RIG-1中Lys43連接的泛素蛋白鏈解鏈，抑制β干擾素啟動子刺激因子1的激活，阻斷抗病毒介質的產生，同時發現組氨酸862是USP15催化活性的關鍵殘基。研究結果表明USP15可以負調節依賴RIG-1的Ⅰ型干擾素誘導途徑，此外，研究進一步分析發現，USP15還可通過其N端DUSP域和C端的USH域與RIG-Ⅰ直接物理結合形成復合體，抑制RIG-Ⅰ發揮功能，進而阻斷抗病毒介質的產生[15]。然而，Pauli等[16]的研究發現USP15可以通過改變E3泛素連接酶三基序25的泛素化水平促進RIG-Ⅰ對干擾素的誘導作用。E3泛素連接酶三基序25是一種泛素連接酶，可將泛素鏈的賴氨酸68連接到RIG-Ⅰ上，使RIG-Ⅰ活化并激活Ⅰ型干擾素的產生[17]，同時，E3泛素連接酶三基序25自身也可被泛素化降解進而抑制RIG-Ⅰ的轉導途徑。此研究結果表明USP15通過對E3泛素連接酶三基序25去泛素化修飾，阻止其泛素化降解并提高其穩定性，從而促進RIG-Ⅰ介導的抗病毒信號轉導通路[16]。

4 USP15參與病毒致病蛋白的調節

4.1USP15提高乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X，HBX)穩定性 乙型肝炎病毒感染在我國一直居高位，2006—2010年的調查數據顯示，我國約有6.9億人有乙型肝炎病毒感染史，乙型肝炎表面抗原陽性者約有1.2億人，乙型肝炎病毒感染導致的肝硬化、肝細胞癌以及肝衰竭每年可導致約35萬人死亡。HBX在乙型肝炎病毒的復制及肝癌的發生中起關鍵作用。Su等[19]研究發現，HBX蛋白通過泛素化途徑被降解，而USP15為HBX蛋白水平的關鍵調節劑，可穩定HBX蛋白。同時，研究還明確了USP15通過與HBX蛋白氨基酸殘基50～80結合區域結合，去除HBX蛋白上的賴氨酸48連接的多聚泛素蛋白鏈，從而提高HBX的半衰期和穩定性[19]。另外，吳燕芳[20]研究也表明USP15降低HBX蛋白的泛素化水平，減少其泛素化降解。

4.2USP15調節人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)E6蛋白穩定性 HPV感染與宮頸癌的發生發展有著密切聯系。E6、E7是HPV的主要致癌基因,其編碼的E6、E7蛋白分別干擾p53和成視網膜細胞瘤相關的腫瘤抑制通路，使細胞周期改變，阻止細胞凋亡及分化[21]。Vos等[22]研究結果表明，USP15可提高E6蛋白的穩定性，而泛素化的E6蛋白可能是USP15泛素肽酶活性的底物，但其發揮作用的具體機制還有待進一步探究。另外，Chiang等[23]研究發現，HPV E6蛋白可以通過與USP15、E3泛素連接酶三基序25形成復合物，促使E3泛素連接酶三基序25的泛素化降解，從而減弱RIG-1信號轉導通路，阻止抗病毒介質的產生。

4.3USP15在人類免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus,HIV)復制及病毒蛋白降解中的功能 HIV編碼多種病毒蛋白，其中Nef蛋白在獲得性免疫缺陷綜合征疾病進程和病毒的復制過程中發揮重要作用[24]。Pyeon等[25]研究發現，Nef蛋白與USP15存在相互作用，USP15可通過泛素蛋白酶系統介導Nef蛋白的降解，提示USP15可能被應用于降解HIV感染細胞中的Nef蛋白，從而抑制病毒的復制及疾病進展。另外，研究還發現USP15還可以通過內體及泛素蛋白酶體介導HIV-1結構蛋白Gag降解，抑制HIV-1的復制，但具體的機制尚未闡明。

5 USP15參與腫瘤相關信號通路的調節

5.2USP15通過核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號轉導通路參與腫瘤發生發展 NF-κB屬于轉錄因子蛋白家族，在靜息細胞中，NF-κB和核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa B,IκB)形成復合體，以無活性形式存在于胞質中。當細胞受細胞外信號刺激后，IκB激酶復合體活化將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點。游離的NF-κB移位到細胞核，與特異性κB序列結合，誘導相關基因轉錄，參與細胞增殖，凋亡及腫瘤生長抑制過程。Schweitzer等[33]的研究發現，USP15參與調節NF-κB通路，通過抑制CRL(cullin-RING ligase)/SCF-TrCP(Skp1-cullin-1-F-box protein-ubiquitin ligase complex)對IκB的泛素化降解，使IκB再累積并穩定,從而抑制NF-κB通路[33]。

5.3USP15參與p53信號通路傳導 p53是抑癌蛋白的一種，主要參與細胞的凋亡過程，在DNA損傷修復，干細胞分化、細胞代謝等過程中同樣存在重要作用，抑制癌癥的發生[34]。MDM2是泛素化過程中E3連接酶的一種，MDM2蛋白的過表達，參與基因的復制、轉錄及轉錄前過程，與多種腫瘤的發生有關，且與抑癌蛋白P53的泛素化降解相關[35]。有研究表明，USP15在黑色素瘤及結直腸腫瘤中過度表達，通過增加MDM2的穩定性降低p53的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡。此研究結果還發現，USP15在抑制腫瘤細胞凋亡過程的同時，抑制抗腫瘤T細胞的免疫應答反應，對于臨床應用方面有重要意義[2]。

6 展 望

DUBs可逆性調節泛素-蛋白酶體途徑中的蛋白質降解，調節多種重要的細胞活動，是轉錄、膜蛋白轉運、核轉運、自噬及免疫應答反應的關鍵調節因子。值得關注的是，DUBs的異常修飾或表達與多種疾病的發生發展有關，但尚缺乏機制研究。其中，USP15作為研究較為深入的DUBs，已被發現在多種疾病的發生過程中存在重要作用，USP15可以通過調節TGF-β、NF-κB、p53等信號通路參與腫瘤的發生發展，包括乳腺癌、結腸癌、膠質細胞瘤、卵巢癌及黑色素瘤等。另外，在一些病毒感染后，USP15也可通過直接或間接作用于病毒蛋白發揮抗病毒功能，其中，USP15可以增加HPV E6蛋白的穩定性，但其在HPV感染的宮頸細胞中呈低表達，提示其可能在HPV的致癌過程中起一定作用?？傊S著研究的深入，USP15會有更多的生物學功能被發現，明確其作用機制及調節機制將成為未來研究的重點，對于日后腫瘤及免疫方面的多種疾病的病因及治療方面的研究和探索具有重要意義。另外，以USP15作為治療疾病的分子靶標或疾病相關的標志物將會有更廣闊的價值及應用前景。