白藜蘆醇對慢性腦缺血大鼠認知損傷和海馬MMP-9和TIMP-1表達的影響研究

張躍奇，王 媛，張志強，胡 敏，張桂青△

(1.新疆醫科大學第五附屬醫院臨床心理科，烏魯木齊，830011；2.烏魯木齊市第四人民醫院精神一科，烏魯木齊，830002；3.石河子大學醫學院第一附屬醫院康復心理科，新疆石河子，832000)

慢性腦缺血是指各種原因導致的慢性腦供血不足、低灌注現象，臨床上主要癥狀為慢性進展性的認知功能障礙[1]。慢性腦缺血參與了臨床多發腦血管病(如血管性癡呆、阿爾茲海默病等)的炎性改變、氧化應激、細胞毒性反應等共同病理過程[2-3]。近年來，白藜蘆醇(resveratrol,RES)的神經藥理作用研究成為熱點。既往研究發現，RES在慢性腦缺血的神經保護、抗神經細胞凋亡方面具有一定的積極作用[4-6]。LIU等[7]研究發現，RES預防性給藥能改善抑郁障礙大鼠的學習記憶能力，但并未闡明其病理機制。目前研究已經證明，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)參與降解細胞外基質等病理生理過程，其活性主要由酶原活化過程和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)調節[8-9]。本研究將采用雙側頸動脈閉塞(bilateral common carotid artery occlusion,BCCA)法建立慢性腦缺血大鼠模型，研究給予不同劑量RES對其認知功能損傷和海馬區基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)及基質金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)表達的影響，探討RES保護認知功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料來源 32只雄性SPF級6周齡Wistar大鼠，體質量(210±20)g，新疆醫科大學醫學實驗動物中心[許可證號:SCXK(新)2003-0001]提供，經糖水喜好實驗篩查及一般體檢無異常發現。分為4組：假手術組(Sham組，8只)、模型組[雙側頸動脈閉塞(BCCA)組，8只]、20 mg·kg-1·d-1RES組(RES-L組，8只)和40 mg·kg-1·d-1RES組(RES-H組，8只)。分組后精心飼養于恒溫恒濕的標準化動物房內。在實驗過程中嚴格遵守新疆醫科大學實驗動物管理條例及管理方法，本實驗經過學院動物倫理委員會審批通過。

1.2慢性腦缺血大鼠模型制備 大鼠適應環境1周后進行實驗。在實驗第1天采用國際慣用的BCCA法建立慢性腦缺血大鼠模型。大鼠建模前8～10 h禁食不禁水。用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，將大鼠仰臥位固定于恒溫實驗臺，暴露頸部皮膚后行正中縱向切口，鈍性分離組織，充分暴露雙側頸總動脈，采用雙重結扎法結扎其遠心端和近心端以阻斷血流。后用青霉素進行局部沖洗，逐層縫合皮膚。操作全程無菌操作。Sham組操作基本相同，只是不進行雙側頸總動脈雙重結扎。待大鼠蘇醒后放回原籠飼養。

1.3RES給藥方法 將RES(美國Sigma公司)溶解于無水乙醇，并用0.5%羥甲基纖維素鈉(CMC)溶液稀釋。RES-L組給予20 mg·kg-1·d-1腹腔注射，RES-H組給予40 mg·kg-1·d-1腹腔注射。Sham組和BCCA組注射0.5%CMC溶液。實驗第1～42天均不間斷給藥。

1.4認知功能評估

1.4.1曠場實驗(open field，OF) 于實驗第35天行曠場實驗。曠場實驗箱置于光線舒適的安靜實驗室內，大鼠逐一放入箱內適應環境30 s，然后通過正上方紅外攝像頭記錄10 min穿格軌跡和站立行為。為避免上只大鼠氣味產生干擾，每只大鼠實驗前需用醫用乙醇徹底清潔并干燥實驗箱。

1.4.2Morris水迷宮實驗 于實驗第36～41天行Morris水迷宮實驗。水迷宮置于光線舒適的安靜實驗室內，水溫(22±2)℃。通過正上方紅外攝像頭記錄大鼠運動軌跡、上臺潛伏期和穿格次數等指標。其中前5 d評估定位航行能力，第6天評估空間探索能力。

1.5RT-PCR反應檢測海馬MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表達

1.5.1海馬組織總RNA提取 于實驗第42天對4組大鼠行心臟灌注取腦，用預冷的PBS溶液沖洗后于冰上快速分離海馬組織，之后用超聲粉碎機將組織粉碎，稱取0.04 g加入預冷的Trizol試劑冰浴研磨，收集裂解液加入200 μL氯仿振蕩混勻，靜置10 min后高速低溫離心10 min，取上清液提取總RNA。用紫外分光光度計測總RNA濃度。

圖1 曠場實驗各組大鼠運動軌跡

1.5.2RT-PCR擴增 將提取的總RNA使用TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA，稀釋后于-20 ℃保存備用。PCR引物序列見表1。PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供，按標準操作配成濃度5 μmol/L，4 ℃保存備用。建立25 μL反應體系(冰上操作)進行RT-PCR擴增：95 ℃預變性10 min后，按順序95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共擴增40個循環。反應結束后確認熔解曲線。每個樣品均做3個平行樣并取均值作為該樣本的Ct值，每一輪反應均做陰性對照。mRNA表達量為2-ΔΔCT，其中ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組，ΔCT=CT目的基因-CT內參基因。

表1 實驗引物序列組成

2 結 果

2.1曠場實驗結果 穿格次數方面，BCCA組穿格次數顯著高于Sham組、RES-L組和RES-H組(P<0.05)，RES-L組顯著高于RES-H組和Sham組(P<0.05)，RES-H組顯著高于Sham組(P<0.05)，見表2，圖1、2。站立次數方面，BCCA組站立次數顯著高于Sham組、RES-L組和RES-H組(P<0.05)，RES-L組顯著高于RES-H組(P<0.05)，但RES-H組和Sham組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖3。

2.2Morris水迷宮實驗結果 前5 d定位航行能力結果顯示，第3天Sham組上臺潛伏期較BCCA組、RES-L組和RES-H組顯著縮短(P<0.05)，第4天和第5天BCCA組和RES-L組上臺潛伏期縮短不顯著，而RES-H組上臺潛伏期縮短與前兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。第6天空間探索能力結果顯示，Sham組和RES-H組均顯著高于BCCA組和RES-L組(P<0.05)，而Sham組和RES-H組之間及BCCA組和RES-L組之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表3，圖4～6。

表2 曠場實驗結果

a：P<0.05，與Sham組、RES-L組和RES-H組比較；b：P<0.05，與RES-H組比較

圖2 曠場實驗各組大鼠穿格次數結果

圖3 曠場實驗各組大鼠站立次數結果

表3 Morris水迷宮實驗結果

a：P<0.05，與BCCA組、RES-L組和RES-H組比較；b：P<0.05，與同組前4 d比較；c：P<0.05，與BCCA組和RES-L組比較

圖4 Morris水迷宮各組大鼠運動軌跡

圖5 Morris水迷宮各組大鼠定位航行能力結果

2.3海馬MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA相對表達量 MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA相對表達結果如表4所示，MMP-9 mRNA方面，Sham組表達量最低，BCCA組、RES-L和RES-H組均有不同程度表達升高(P<0.05)，但RES-H組表達量升高程度低于BCCA組和RES-L組(P<0.05)，而BCCA組和RES-L組差異無統計學意義(P>0.05)。TIMP-1 mRNA方面，Sham組表達量最低，BCCA組、RES-L和RES-H組均有不同程度表達升高(P<0.05)，但RES-H組表達量升高程度高于BCCA組和RES-L組(P<0.05)，而BCCA組和RES-L組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖6 Morris水迷宮各組大鼠空間探索能力結果

表4 海馬MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA相對表達量 (n=8)

3 討 論

慢性腦血管病發病年齡有年輕化的趨勢，對患者的生存質量產生嚴重影響。慢性腦缺血狀態與腦血管病的病理過程密切相關[10]，可導致進展性的學習記憶等認知功能衰退和情緒障礙[11]。本研究建立BCCA慢性腦缺血大鼠模型，待疾病進入慢性期(實驗第35～41天)后，通過曠場實驗和Morris水迷宮實驗評估其焦慮狀態和學習記憶能力。本研究發現，BCCA組大鼠穿格次數及站立行為次數均多于Sham組，表明BCCA組大鼠焦慮水平升高，這與既往研究結果類似[12]。學習記憶方面表現出能力下降，即BCCA組大鼠上臺潛伏期明顯高于Sham組，穿格次數明顯低于Sham組，這與既往研究結果相同[13]。以上結果均表明BCCA慢性腦缺血大鼠模型成功復制了慢性腦缺血患者的臨床表現。

研究發現，RES具有廣泛生物活性，在抗炎、抗氧化、神經細胞保護及抗凋亡方面均表現出有益作用[14-19]。研究表明，大腦海馬區是學習記憶等認知相關功能的重要腦區，且海馬神經細胞對缺血缺氧十分敏感[3]。有研究發現，RES能明顯減輕因缺氧導致的體外培養海馬細胞的損傷[20]。也有研究顯示，RES預處理能改善腦卒中大鼠模型的腦梗死面積及腦積水程度[21]。本研究采用兩種濃度的RES對慢性腦缺血大鼠進行干預，結果顯示在BCCA組、RES-L組和RES-H組均表現出不同程度的焦慮樣行為增多、水迷宮上臺潛伏期延長和穿格次數減少，然而RES-H組以上癥狀程度較與BCCA組和RES-L組明顯改善，但BCCA組和RES-L組差異無統計學意義(P>0.05)。這表明40 mg·kg-1·d-1RES干預可在一定程度上改善慢性腦缺血大鼠的學習記憶能力及焦慮水平，這支持既往研究結果[22-23]。

為進一步探討RES對慢性腦缺血的神經保護作用的病理機制，本研究通過RT-PCR技術測定了海馬區MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA的相對表達量。大量研究表明，MMP-9具有強大的細胞外基質降解能力，同時又可激活TNF-α及IL-1等炎癥因子，因此MMP-9表達異常升高成為反映腦神經細胞外基質降解的重要標志之一[24-26]。本研究發現，海馬區MMP-9 mRNA在Sham組表達最低，BCCA組表達明顯增加，RES-H組表達少量增加。這提示慢性腦缺血后持續40 mg·kg-1·d-1RES干預可在一定程度上抑制破壞性MMP-9 mRNA表達升高。據報道，MMP-9基因敲除小鼠模型能減輕其因缺血缺氧導致的腦神經損傷[27]。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑，參與阻斷其細胞外基質降解[28]。本研究發現，海馬區TIMP-1 mRNA在Sham組表達最低，BCCA組表達少量增加，RES-H組表達明顯增加，這提示慢性腦缺血后持續40 mg·kg-1·d-1RES干預可在一定程度上促進保護性TIMP-1 mRNA表達升高。本研究還發現，RES-L組兩種mRNA表達情況與BCCA組均無明顯差異，提示RES對缺血性腦損害的神經保護有劑量依賴性。

綜上所述，本研究認為持續給予慢性腦缺血大鼠40 mg·kg-1·d-1RES腹腔注射，能延緩慢性腦缺血引起的認知功能減退和焦慮狀態，其病理生理機制可能與RES參與海馬區MMP-9表達抑制和TIMP-1表達促進有關，這為今后臨床治療慢性腦缺血患者提供了新思路，但RES調控海馬區MMP-9和TIMP-1表達的確切機制還有待進一步研究。