小鼠初級聽皮層第6層同側響應神經元對對側響應特征頻率的修飾加工

嚴林清，張新貴，肖中舉△

(1.南方醫科大學基礎醫學院生理學教研室，廣州 510515；2.汕頭大學精神衛生中心，廣東汕頭 515065)

初級聽覺皮層(primary auditory cortex，A1)在雙耳整合中發揮著關鍵的作用，它接受來自丘腦的上傳投射和皮層間的相互投射[1-2]。通過整合同側和對側感覺的輸入，皮層神經元在雙側信息整合上有多種功能表現。例如在聲音處理上，聲源定位主要依賴雙耳時間差(interaural time difference，ITD)和雙耳強度差(interaural level difference，ILD)[3]。A1作為聽覺傳導通路到達大腦皮層的第1站，單側皮層損傷缺損實驗證實A1參與聲源定位[4]，同時也存在雙耳整合神經元，此類神經元的拓撲學分布是客觀存在[5]。

根據不同單側耳神經元響應特征把雙耳神經元簡單劃分為一側耳興奮，另外一側耳也興奮和一側耳興奮、另外一側耳抑制類神經元[6]。對于雙耳整合神經元的功能特點，目前普遍認同的觀點是：神經元編碼ITD或者ILD，進而轉換為空間特征的信息，完成對聲音空間位置的編碼[7]。但上述研究局限在對聲源定位的研究上，對雙耳整合頻率研究的方法較傳統，因此與聲音頻率相關上雙耳整合的突觸機制并不清楚。通過多單位記錄手段證明，A1從淺層到深層的細胞集群具有相似的特征頻率(characteristics frequency，CF)，即具有相似功能或者相似的響應特點[8]，也就是存在相似頻率垂直功能柱。但上述研究的局限性在于對對側優勢耳響應進行了相似頻率的劃分，并沒有考慮同側耳(Ipsi)的輸入會對對側耳(Contra)造成的影響，因此單側耳響應的頻率功能柱并不代表雙側耳(Bi)共同響應的反應特點。另外，由于A1第6層(layer 6，L6)位置較深的關系，記錄較難，并不能很好地在在體清醒動物上開展單細胞膜片鉗記錄，多單位記錄并不能精確地得到帶寬、CF等神經元特征性變化的參數[9]。

本文首先在體清醒動物單細胞貼附式記錄得到A1 L6同側有或者無聲響應的神經元雙耳整合后準確的特征參數：閾值上20 dB帶寬(BW20)、反應延時(Onset-Latency)、閾值(Threshold)、CF等，再通過在體全細胞膜片鉗的方法研究雙耳整合神經元特征參數的突觸機制，最后用雙重免疫熒光標記法證實同側聲刺激激活同側聽皮層L6的抑制性神經元，進而可能參與調節對側響應的抑制性輸入。

1 材料與方法

1.1材料 本實驗采用在體清醒動物的膜片鉗技術，所用的電極為玻璃電極，拉制后呈椎形，尖端直徑約1 μm，結合自動推進器能進行精細操作；所使用的78只SPF級C57BL/ 6J雌性小鼠均由南方醫科大學實驗動物中心提供，周齡6～8周。小鼠因為體質量較輕，雌性小鼠也較安靜，清醒狀態下小鼠的肢體運動對被鉗制的細胞的穩定性可以經由訓練控制，能在小鼠運動狀態下還能記錄到被鉗制的細胞，因此小鼠比較適合做清醒動物的在體膜片鉗記錄模型。實驗全過程均在南方醫科大學動物保護和使用管理委員會的批準和監督下進行。

1.2方法

1.2.1實驗動物手術準備 實驗小鼠用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉后，轉置于立體定位儀進行定位，將頭背面向左傾斜70°左右并固定小鼠頭部。剪開小鼠頭部皮膚和部分肌肉，充分暴露顳骨和頂骨，以后鹵上骨縫與骨隆交點為零點，旁開0.3 mm，分別在距此點向前鹵方向1.5～3.0 mm處標記A1的位置。并在小鼠非聽覺相關核團埋置參比電極，用牙科水泥將一根長約1.5 cm的自制鐵釘固定在顱骨表面。待牙科水泥完全凝固后，將小鼠置于實驗臺上，頭釘末端插入一已經固定在防震臺的金屬固定桿上的小孔里，調節好小鼠頭部讓其處于合適的體位，并上緊螺絲固定住頭釘，在體視顯微鏡下用小鉆頭在已經標記的A1位置的顱骨上鉆約0.5 mm×0.5 mm大小的顱窗，充分暴露聽皮層，并保護好暴露的腦組織及創口。待第2天小鼠恢復清醒后給予動物訓練，動物訓練放在類似記錄時的環境下，小鼠每次訓練2～4 h，每天3次，訓練2 d，訓練期間每隔1小時在紅外攝像頭下觀察并記錄老鼠的狀況，待小鼠能長時間內保持安靜狀態后進行記錄。

1.2.2在體清醒動物細胞貼附記錄 細胞貼附式記錄(cell-attached recording)所用儀器有TDT system Ⅲ系統、膜片鉗放大器700B (Axon Instrument，美國)和數模轉換器1440A (Axon Instrument，美國)。通過軟件Clampex10.2 和Brainware控制實驗條件和保存數據。找到聽覺相關神經元后，閉合場行頻率-強度掃描，純音序列強度：0～70 dB SPL(10 dB SPL的間隔)，線性頻率：2～48 kHz(1 kHz間隔)，上升/下降時間為5 ms，時程為50 ms，隨機給聲，每個聲音2次/秒，每個聲音重復3～5次。定義記錄側為給聲同側，Ipsi、Contra和Bi隨機給聲，并將神經元的電活動和聲音方案保存在軟件Brainware的DAM文件里和Clampex軟件的ABF文件里。在細胞外貼附的膜片鉗記錄實驗中，通過同側給聲觀察同側皮層神經元是否有給聲后發放，如果發放數高于自發放的3倍的標準差定義為同側給聲響應類神經元，反之，則定義為同側給聲無響應神經元。

1.2.3在體全細胞記錄 全細胞記錄是以細胞貼附式記錄為基礎，達到高阻(GΩ)封接，給予一定負壓抽吸讓電極管內的細胞膜撕裂，從而使電極內液與細胞內液的成份互相交換，可用不同鉗制方式反映膜電位或者膜電流的變化[10-11]。當鉗制在0 mV時(鈉離子的平衡電位)，可記錄到抑制性突觸后電流(IPSC)；當鉗制在-70 mV時(氯離子的平衡電位)，可記錄到興奮性突觸后電流(EPSC)。給聲方案如上，采取同一強度60 dB不同頻率(3～45 kHZ)隨機掃描3遍，聲音刺激方案保存在Brainware的DAM文件里，IPSC和EPSC的波形保存在Clampex軟件的ABF文件里面。在全細胞實驗中，通過同側給聲觀察同側皮層神經元是否有給聲后閾下輸入，如果疊加后的反應波形大于基線的3倍標準差定義為同側給聲響應類神經元，反之，則定義為同側給聲無響應類神經元。

1.2.4灌注固定和雙重免疫螢光 為避免運動或者外在環境噪聲對小鼠造成的干擾，小鼠給聲前予以20%烏拉坦(0.45～0.50 mL/100 g)麻醉。固定頭部，一側外耳道口放置閉合聲場軟管(定義給聲同側)，在屏蔽室內隔音、避光放置3 h后單側給純聲90 min(12 kHz，60 dB，50 ms duration，給聲頻率2次/秒)。給聲結束后小鼠仍處于深度麻醉狀態，隨后立刻采用心臟灌流法，依次灌注4 ℃保存的冰凍0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛各50 mL，固定后擇期進行切片，切片厚度每片為40 μm。根據小鼠腦立體定位圖譜收集目標腦片進行免疫螢光雙染[12]。步驟如下：0.01 mol/L PBS漂洗3遍，每遍10 min；0.3%雙氧水孵育30 min(避光，防止雙氧水見光分解)；PBS漂洗3遍，每遍10 min；0.25% Triton(打孔用)孵育2 h；PBS漂洗3遍；2.5%山羊血清封閉2 h；一抗4 ℃孵育過夜(c-Fos∶sc-52為1∶500；Anti-GAD67 Antibody∶clone 1G10.2，1∶1 000，稀釋液為5%山羊血清)；復溫后用0.01 mol/L PBS漂洗3遍，每遍10 min；二抗室溫避光孵育2 h(Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG (H+L)，1∶500；Alexa Fluor?594 goat anti-rabbit IgG(H+L)，1∶500，稀釋液為0.01 mol/L PBS)；PBS漂洗3遍；移至干凈的載玻片，自然風干后封片，使用共聚焦顯微鏡(Nikon,A1R,Japan)觀察，大腦切片經免疫熒光染色后，使用藍光(激發光波長為488 nm)為激發光，可檢測到經過GABAergric染色神經元的胞體為黃綠色熒光；使用綠光(激發光波長為568 nm)激發，可檢測到經過c-fos蛋白的神經元胞核為橙紅色熒光[13]，分別在低倍或者高倍進行檢測，儀器會根據不同厚度的細胞層進行分層掃描，把掃描到的染色結果保存為圖像。

A：不同頻率-強度純音組合刺激得到感受野的三組偽彩圖；B：與圖A對應的刺激后時間直方圖；C：Contra和Bi所在頻率的發放曲線圖；D～E：Bi和Contra的CF和閾上20 dB帶寬(BW20)擬合曲線；F～G：△Threshold和△Latency的細胞數柱狀分布圖

圖1 同側無響應神經元電生理結果

A：不同頻率-強度純音組合刺激得到感受野的三組偽彩圖；B：與圖(A)對應的刺激后時間直方圖；C：Ipsi、Contra和Bi所在頻率的發放曲線圖；D、F、G：CF位移、△Threshold和△Latency的細胞數柱狀分布圖；E：Bi和Contra BW20擬合曲線

圖2 同側有響應神經元電生理結果

2 結 果

2.1同側無聲響應神經元的雙耳反應特點 圖1(A)Ipsi沒有TRFs，圖中有零散的自發放動作電位數，Contra和Bi有TRFs，對純音的響應呈V型。圖1(B)是與圖1(A)對應的PSTH，Ipsi在50 ms給聲后沒有響應，Contra和Bi在50 ms給聲后有PSTH，且發放類型較為一致。圖1(C)Contra和Bi的同一個同側無聲響應神經元的重合CF，重合頻率為20 kHZ。圖1(D)Bi和Contra的CF的擬合曲線參數：r=0.997 1，slope=1.004 4；Contra CF：(21.800 0±9.857 6)kHZ，Bi CF：(21.730 0±9.857 6)kHZ；t=0.141，P=0.89，n=15。Bi和Contra的CF改變差異無統計學意義(P>0.05)。圖1(E)15個神經元的Bw20擬合曲線參數：r=0.988 8，slope=0.994 4；Con-tra：(21.413 0±5.142 3)kHZ，Bi：(21.625 0±4.815 6)kHZ；t<-0.45，P=0.735，n=15。Contra和bi的Bw20改變差異無統計學意義(P>0.05)。圖1(F)Contra和Bi的△Threshold有13個神經元差值為0 dB，有2個神經元差值為-10 dB，有1個神經元差值為10 dB，而圖1(G)的△ Latency的神經元分布有12個神經元差值為0 ms，2個神經元差值為-2 ms，1個神經元差值為-1 ms。

A：全細胞模式下突觸后電流曲線；B：由圖(A)得到EPSCs和IPSCs的聽覺優勢度指數-頻率關系的趨勢圖；C：由圖3(B)得到各個頻率EADI和IADI的比值統計圖

圖3 同側有響應神經元的全細胞結果分析

A：c-fos陽性表達腦片圖；B：實驗組和對照組的柱狀統計圖；C：左圖為雙重免疫熒光染色腦片圖，右圖為局部放大圖，黑色箭頭所示為c-fos陽性的GABAergic神經元

圖4 同側給聲的c-fos蛋白表達結果

2.2同側有聲響應神經元的雙耳反應特點 圖2(A)Ipsi、Contra和Bi分別有不同TRFs，Ipsi對純音的反應較弱，CF在高頻位置，而Contra和 Bi對純音響應較強，CF位置在不同的頻率，三者反應類型都為V型。圖2(B)是與圖2(A)對應的PSTH，三者在50 ms給聲后都有反應，Contra的動作電位發放數最多，三者發放類型較為一致。圖2(C)Ipsi、Contra和Bi的同一個同側有聲響應神經元分別有不同的CF，Ipsi為44 kHZ，Contra為26 kHZ，Bi為39 kHZ。圖2(D)13個同側有聲響應神經元中有7個CF有位移，3個CF無變化，3個因為CF在高頻位置無法辨認。圖2(E)13個同側有聲響應神經元中的Contra和Bi的Bw20擬合曲線參數：r=0.971 2，slope=0.993 7；Contra：(19.615 0±6.252 2)kHZ，Bi：(19.923 0±6.909 7)kHZ；t<-0.47，P=0.647，n=13。Contra和Bi的Bw20改變差異無統計學意義(P>0.05)。圖2(F)Contra和Bi的△Threshold有11個神經元差值為0 dB，有1個神經元差值為-10 dB，有1個神經元差值為10 dB，而(G)的△ Latency有11個神經元差值為0 ms，1個神經元差值為-2 ms，1個神經元差值為-1 ms。

2.3同側有聲響應神經元的全細胞反應特點 圖3(A)Ipsi、Contra和Bi都有IPSC和EPSC，IPSC的幅度值較弱，Contra和Bi的IPSC和EPSC較強。圖3(B)中，CF及其附近(矩形灰框)的IADI值較高，而EADI變化不明顯。圖3(C)IADI的值為(0.180 0±0.190 0)pA/kHZ，EADI的值為0.095 0±0.940 0 (pA/kHZ)(t=-3.275，P<0.01，n=43)，EADI和IADI的變化差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4同側響應的神經元的c-fos變化特點 從圖4(A)EG有黑色點密集分布在L5和L6，CG則是零散分布。圖(B)中EG和CG的c-fos陽性細胞數計數差異有統計學意義(t=-13.98，P<0.01，n=10)。圖4(C)有神經元表達c-fos蛋白(橙紅色標記細胞核)，也存在GABAergic神經元(黃綠色標記胞體)，同時也有大量表達c-fos蛋白的GABAergic神經元(兩種顏色均標記)。

3 討 論

動物在麻醉狀態下，聽皮層神經元的活動降低，對聲音的反應延時、延長[14]，在麻醉動物上得到A1 L6雙耳整合的結果并不能很好地反映神經元的真實響應。本文在清醒動物上開展對聽皮層L6的雙耳整合的電生理研究，更能還原小鼠在自然狀態下雙耳整合的結果。下丘雙耳整合研究的機制當中，雙耳響應增益值的大小主要依賴賴于ILD[15]，當雙耳給予相同的聲音，Ipsi的輸入并不影響Contra的反應特性(圖1)，特別是CF(圖1C)，說明同側無聲響應神經元并不影響對側的CF，因此這類神經元接受的輸入可能并不在皮層發生整合，有可能接受下丘或者更低位核團雙耳整合后的直接上傳的結果。A1 L6部分神經元接受丘腦的直接輸入，比其他層有著更短的反應延時，而且反饋投射到丘腦核團，其投射的復雜性取決于該層神經元有著復雜的細胞種類[16]，該層除了存在同側無聲響應神經元外，也存在同側有聲響應的神經元(圖2)，本文結果證實了該層存在同側聲響應的神經元，而且這類神經元能夠改變對側響應的CF(圖2C～D)，同一神經元Ipsi的輸入可能與Contra的輸入可能發生皮層內的整合，導致同側給聲后，對側響應的CF發生偏移(圖2C～D)。之前的研究證實，聽覺皮層神經元的TRFs受興奮性和抑制性輸入整合的影響，當興奮或者抑制發生改變，神經元響應的基本特性會發生改變[17-18]。在全細胞記錄模式下，更能清楚地看到興奮性和抑制性輸入的變化(圖3)，本實驗同側和對側刺激都存在輸入的情況下，證實了同一個神經元同時接受同側和對側的兩種輸入(EPSCs和IPSCs)，當雙耳同時給聲時，同側影響了對側的抑制性輸入(圖3C)，特別在CF附近抑制作用更強(圖3B)，這種同側的干預對對側響應的CF有修飾加工作用。c-fos基因參與機體眾多功能活動的信號轉導和調控過程，特別是腦神經功能活動，多種刺激因子，如應激、聲光刺激、體感刺激等均可誘導神經系統中c-fos基因的表達。細胞受刺激后，胞核內c-fos基因被激活，轉錄形成mRNA,后者進入胞質，翻譯合成相對分子質量55×103的核酸蛋白，即Fos蛋白。Fos蛋白經磷酸化修飾后返回胞核內與另一家族原癌基因c-jun編碼的Jun蛋白形成復合物。Jun與哺乳動物基因轉錄因子AP-1結構、功能相似，Jun/Ap-1為其表示形式。Fos和Jun/AP-1通過各自的a-螺旋區以光價鍵結合形成亮氨酸拉鏈，Fos-Jun/AP-1復合物與目的基因結合，激活目的基因的轉錄活性。通過上述過程，細胞外的各種刺激信號轉化為調節細胞核內基因表達的信號，產生細胞的刺激效應，可作為接受某種特定刺激的神經元激活的標記，是目前較為理想的神經功能活動的定位標記[19]。聽覺信息在上橄欖復合體(superior olive complex，SOC)開始交叉傳到對側皮層[20]。雙耳同時給聲后，實驗中發現同側聲輸入會影響對側響應的CF，同側的聲輸入沒有直接上傳到同側皮層的傳導通路，因為聲音信息是沿著對側交叉上傳到對側A1加工處理。由于兩側大腦皮層間通過胼胝體存在大量的互相傳導纖維[21]，同側聲輸入傳到對側皮層后，有可能經胼胝體傳到同側皮層的某一類神經元對對側CF產生影響。為了觀察同側聲輸入是否能引起同側初級皮層神經元的活動，本實驗先采用單獨Ipsi連續給聲90 min的方法，再取材染色，發現同側A1的L6同側給聲跟同側不給聲的空白對照組(圖4A)的c-fos蛋白相比有明顯差異(圖4B)，這就定位到同側給聲后同側聽皮層L6有神經元產生同側響應，使得神經元產生動作電位發放活動性指標的變化，持續性的動作電位發放能使c-fos基因激活持續表達c-fos蛋白，可以在形態學直觀看到同側給聲后神經元響應的位置，證實同側給聲有到同側皮層的間接通路。雙側同時給聲時，同側聲輸入使得同側L6產生有動作電位發放的活性神經元，這類神經元有可能對對側響應的CF產生調節作用，但不清楚是抑制性中間神經元還是興奮性椎體神經元對CF產生調節作用。已有文章證實，對側聽覺皮層有纖維投射到同側L5抑制性中間神經元的通路，這類抑制性神經元能特異性調節椎體神經元的活動[22]；L5和L6同是信息輸出層，有相似的功能，參與離皮層投射，有大量纖維投射到丘腦和下丘，參與調節椎體神經元的活動[23]。本實驗記錄到雙側給聲后CF的改變是跟抑制性變化相關，然后再行免疫熒光雙染實驗，發現在L6有大量的抑制性神經元表達c-fos蛋白(圖4C)，而同側聲輸入沒有直接上傳到同側皮層的通路，這更加證實了同側聲輸入可能經過對側皮層跨胼胝體到達同側L6的抑制性神經元調節對側響應的CF，實驗中通過持續給聲激活神經元的c-fos基因，抑制性神經元的發放頻率較椎體神經元快[24]，c-fos蛋白的表達跟神經元的放電率有直接關系，發放率越高，相同時間內細胞受到的刺激越多，c-fos表達就越強，同側接受相同聲音刺激時，抑制性神經元的快放電率特征有調節其他神經元活動的優勢，雙耳整合后由于抑制性輸入發生變化導致CF改變的原因更有可能是因為抑制性神經元的快放電率引起的，抑制性神經元能提供其他神經元抑制性輸入，參與抑制性調節。在聽覺皮層，存在許多不同種類的抑制性神經元，突觸的抑制參與了感受野的形成，加強聽覺時間信息的認知和調節增益值[25]。本實驗通過雙重免疫熒光染色，證實同側給聲激活了大量聽皮層L6的GABAergic神經元(圖4)，而全細胞結果又證明了對側響應的抑制性輸入被同側輸入影響，導致興奮-抑制平衡失去同步變化趨勢，而同側激活大量的抑制性神經元被認為可能參與調節對側響應。綜上所述，可以推測雙耳同時給聲時，得出結論：(1)同側無響應神經元的同側輸入并不影響對側響應的CF；(2)同側有響應神經元的同側輸入對對側響應的CF有修飾加工作用，雙耳同時給聲時，同側輸入影響對側的抑制性輸入，從而導致雙耳響應中對側CF發生偏移；(3)同側輸入主要激活同側聽皮層L6的抑制性神經元，被激活的抑制性神經元可能參與對側特性頻率的加工和修飾。