人工誘導葡萄球菌產生耐藥性的研究

曾森 葉亞瓊 李嘉怡 陳仁貴 婁華 朱海琦 李培文 吳志勝 劉霜霜 劉俊杰

【摘要】目的 為了探究“超級”細菌存在的可能性及人工方法是否會誘導產生“超級”細菌。

方法 實驗采用以葡萄球菌為實驗菌，按NCCLS推薦的紙片擴散法敏感試驗測定12種抗菌藥物對實驗菌株的抑菌圈直徑，并選出該菌株最敏感的藥物頭孢唑啉；經多次實驗，發現用微量肉湯稀釋法測定頭孢唑啉對葡萄球菌的MIC值效果最佳，以及相對應的菌液稀釋比例和藥液與菌液混合的最適比例和一種使用頭孢唑啉體外人工誘導葡萄球菌耐藥的方法。結果 在實驗室條件下，經過55代的傳代誘導，細菌對β-內酰胺類藥物產生完全耐藥性；同時發現該耐藥菌株對所測非β-內酰胺類抗生素（喹諾酮類、四環素類、氨基糖苷類和糖肽類）的敏感度增高，對氨基糖苷類的新霉素敏感度增加尤為明顯，以及耐藥菌株的形態學變化。結論 說明人工方法誘導產生“超級”細菌的可能性是比較小的。

【關鍵詞】“超級”細菌；葡萄球菌；藥敏實驗；MIC

【中圖分類號】R969 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095-6681.2019.5..02

“超級細菌”是具有多重耐藥性細菌的總稱，包括耐青霉素的金黃色葡萄球菌（PRSP）、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）等[1]。葡萄球菌（Staphylococcus）作為化膿性感染、敗血癥或膿毒性敗血癥的主要病原體，常造成奶牛乳腺炎等化膿性或毒素性疾病，造成巨大經濟損失，嚴重影響畜牧業的發展[2]。耐藥菌是這些年來社會上的熱議話題之一，特別是MRSA、“超級”細菌報道以來，一度造成社會上的恐慌，甚至曾有報道稱：到2050年人類死于耐藥菌的病例將超過癌癥，科學家們對耐藥菌的研究日益迫切。“超級”細菌的耐藥性形成可能與用藥劑量、用藥頻度與寬度（使用藥物的頻率與種類多少）、細菌的自身變異（物理、化學、生物性變異）等有關。細菌耐藥性產生的原因極可能是細菌多次與藥物接觸（如抗生素濫用問題），導致細菌成為耐藥菌。

1 材料與方法

1.1 細菌的來源與鑒定

葡萄球菌菌株由佛山科學技術學院廣東省預防獸醫重點實驗室提供，經平板劃線提純、觀察菌落形態特征、革蘭氏染色鏡檢、高鹽甘露醇培養基鑒定，特征與葡萄球菌一致。純化菌株用50%甘油存于-20°C冰箱備用。

1.2 試劑和儀器

藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，批號分別為：頭孢唑啉（批號：S1012）、頭孢他啶（批號：S1019）、青霉素（批號：S1001）、苯唑西林（批號：S1002）、氨芐西林（批號：S1003）、萬古霉素（批號：S1054）、氧氟沙星（批號：S1049）、諾氟沙星（批號：S1047）、恩諾沙星（批號：S1081）、新霉素（批號：S1034）、四環素（批號：S1036）、多西環素（批號：S1037）；頭孢唑啉標準品購自廣東省藥品檢驗所，效價99.3%；培養基購自廣東省環凱微生物科技有限公司。實驗用品均在有效期內使用。

1.3 試驗方法

1.3.1 原代葡萄球菌12種抗生素的藥敏試驗

按NCCLS（美國臨床和實驗室標準協會）推薦的Kirby-Bauer瓊脂擴散法藥敏試驗測定12種抗生素對實驗菌株的敏感程度[3]。挑單個菌落至液體培養基培養12 hr后，校正菌液濃度至0.5麥氏比濁度。均勻涂布于平板表面，然后將紙片貼于瓊脂平板表面，37°C培養18～24 hr后測抑菌圈，選出較敏感藥作為誘導抗生素（頭孢唑啉）。

1.3.2 原代葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC值）的測定

用96孔微量肉湯稀釋法測定MIC[5]。挑單個菌落接于液體培養基，37℃培養18～24 hr后稀釋10倍制成菌懸液。將頭孢唑啉標準品配成濃度為512 μg/mL的頭孢唑啉藥液，然后倍比稀釋獲得多濃度梯度藥液。將稀釋的藥液與制成的接種懸液按1：9的比例分別加入10個濃度梯度藥的孔中，藥濃度逐孔遞減；第11孔加100 μL營養肉湯作陰性對照，第12孔加100 μL稀釋的菌懸液作陽性對照，37°C孵育

18～24 hr觀察結果。

1.3.3 頭孢唑啉體外誘導原代葡萄球菌耐藥

根據MIC的測定結果，取最小抑菌濃度下一濃度孔的菌液（實際藥物濃度為0.1 μg/mL），按菌液：頭孢唑啉藥液：普通營養肉湯1：1：8比例混合接種至試管，于37°C培養24 hr，連續傳代，逐步提升藥液濃度，每隔10～20代測定敏感度。傳至第55代，實際誘導的藥物濃度為51.2 μg/mL，初步定義為耐藥菌。

1.3.4 耐藥菌耐藥性的測定

1.3.4.1 測定耐藥菌對原來12種抗生素的敏感性

方法參照1.3.1[3]。平板上挑取耐藥菌的單個菌落至液體培養基培養12 hr后，校正菌液濃度至0.5麥氏比濁標準。均勻涂布接種于平板表面，均勻將含藥紙片貼于含菌平板表面，37°C培養箱培養18～24 hr后測量抑菌圈。

1.3.4.2 測定耐藥菌的最小抑菌濃度（MIC值）

方法參照1.3.2[5]。稀釋的10個濃度梯度藥液分別加到無菌96孔板中，然后將稀釋的藥液與制成的耐藥菌接種懸液按1：9的比例分別加入10個濃度梯度的10孔中，藥物濃度逐孔遞減，濃度最高為51.2 μg/mL；第11孔加100 μL普通營養肉湯作為陰性對照，第12孔加100 μL稀釋后的耐藥菌接種懸液作為陽性對照，37°C培養18～24 hr觀察結果。

2 結 果

2.1 耐藥葡萄球菌形態學變化

耐藥菌株普通營養瓊脂平板菌落細小，稍白；耐藥菌株在甘露醇NaCl瓊脂平板上平板顏色淺黃，形態與原代菌一致。加頭孢唑啉藥液培養的菌液革蘭氏染色油鏡鏡檢形態松散，黏著度低，極少或不形成葡萄串狀。菌落革蘭氏染色油鏡鏡檢與典型葡萄球菌形態一致。

2.2 原代與耐藥葡萄球菌12種抗生素藥敏實驗結果與相關變化

多次藥敏試驗結果，原代葡萄球菌對12種抗生素均敏感，誘導的耐藥菌株對所測的β-內酰胺類藥物的完全耐藥，同時發現耐藥菌對所測非β-內酰胺類原先敏感的藥物的敏感度增加。

2.3 原代與耐藥葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC值）測定結果及變化

測定MIC的實驗菌株設為第一代，第二代開始用頭孢唑啉對菌株體外人工誘導。研究發現，每次提升藥物濃度，實驗菌株逐步適應環境，生長速度由慢變快。傳至第55代，實際藥物濃度為51.2 μg/mL，獲得完全耐藥的葡萄球菌菌株。測得頭孢唑啉對耐藥菌株的MIC值

3 討 論

目前研究一般認為“超級”細菌的耐藥性形成可能與用藥劑量、用藥頻度與寬度（使用藥物的頻率與種類的多少）、細菌的自身變異（物理、化學、生物性的變異）等有關。本實驗，經過55代的體外多步傳代誘導，成功誘導出耐藥葡萄球菌。在自然環境下，細菌長期接觸低劑量的一種或多種抗生素的可能性是比較小的。說明葡萄球菌在自然環境下對頭孢唑啉是不太容易產生耐藥性的。本方法所需儀器設備少，能較好解決操作難度和成本的問題且誘導效率、準確率和成功率比較好。本實驗方法申請的發明專利申請已經受理。

本實驗誘導的耐藥菌株對所測β-內酰胺類抗生素均由敏感變成完全耐藥、對所測非β-內酰胺類抗生素敏感度增加，喹諾酮類抗生素氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星的抑菌圈分別從30、24、26 mm升至35、30、35 mm，四環素類抗生素四環素和多西環素的抑菌圈分別從26、21 mm升至35、30 mm，氨基糖苷類抗生素新霉素的抑菌圈從19 mm升至

33 mm，糖肽類抗生素萬古霉素的抑菌圈從16 mm升至

23 mm。其中新霉素的抑菌圈增加最多，敏感度升高最為明顯，其次是恩諾沙星和四環素。

根據目前的研究，耐藥性機制分為：細菌產生滅活酶或鈍化酶，破壞抗生素的結構，使其失去活性；改變抗生素作用的靶位蛋白結構和數量，使細菌對抗生素不再敏感；細菌細胞膜滲透性改變，使抗生素不能進入菌體內部；細菌主動藥物外排泵作用，將抗生素排出菌體；細菌生物被膜的形成，降低抗生素作用等[1-9]。而該耐藥菌的耐藥機制及對非β-內酰胺類抗生素敏感度增加的原因尚不清楚，有待進一步深入研究。

通過本實驗說明低劑量藥物多次體外誘導可以誘導葡萄球菌產生對β-內酰胺類抗生素的完全耐藥；但該耐受菌株卻大大增加了對其他類抗生素的敏感性。同時在此呼吁臨床應合理使用抗生素。

參考文獻

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本文編輯：趙小龍