扶正祛積湯聯合埃克替尼對肺癌移植瘤Fas、Bax和CyclinD1表達的影響*

趙同偉 潘智敏 袁國榮 盧麗琴 谷建鐘 洪譽鵬 蘇 丹 周紅英 洪朝金 欽志泉#

1 浙江省人民醫院 浙江 杭州 310014

2 杭州醫學院附屬人民醫院 浙江 杭州 310014

3 浙江省中醫院 浙江 杭州 310006

本研究利用人肺腺癌A549細胞（EGFR野生型）構建裸鼠移植瘤模型，驗方“扶正祛積湯”聯合埃克替尼干預后，研究中西醫結合治療的協同抑瘤作用并探討對移植瘤Fas、Bax和CyclinD1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 實驗材料：扶正祛積湯來自于潘智敏教授臨床經驗方；埃克替尼自購自浙江貝達藥業有限公司（產品批號：20161207）。

1.1.2 實驗動物：20只BLAB/c裸鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司[（許可證號：SCXK（蘇）2016-0010］，均雄性，6～8周齡，重量16～24g。

1.1.3 實驗試劑：Fas抗體（affinity Biosciences）、Bax抗體（affinityBiosciences）、CyclinD1抗體（Cell Signaling Technology）、WB相關試劑（江蘇凱基生物技術股份有限公司）、DAB顯色試劑盒（碧云天生物技術公司）。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 扶正祛積湯組成及制備：全方由南沙參、北沙參、太子參、莪術、貓爪草、魚腥草等15味草藥組成。在浙江省立同德醫院中西醫結合腫瘤研究所煎制和抽提，經分裝滅菌，4℃冰箱保存備用。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的建立及分組灌胃：每只裸鼠腋下接種1×106個細胞，接種后14天，皮下移植瘤形成。將成瘤的裸鼠隨機分為4組，每組5只，分籠飼養，按分組灌胃，分別為模型組（生理鹽水）、扶正祛積湯組（原液濃度50%）、埃克替尼組（50mg/Kg/d）、扶正祛積湯聯合埃克替尼組（兩藥劑量同單藥組），每組均灌胃200μl，1次/天，共21天，末次給藥24h脫頸處死裸鼠，取出移植瘤進行后續實驗。

1.2.3 腫瘤體積、抑瘤率和增效率的測定：灌胃前1天，灌胃第6、11、16和21天，測量移植瘤的最大長徑（a）和橫徑（b），再根據公式[體積=1/2×ab2；抑瘤率=（C-T）/C×100%，C為模型組移植瘤的平均體積，T為處理組移植瘤的平均體積］計算出各組抑瘤率和聯合組增效率。聯合組扶正祛積湯增效率(%)Q=(聯合組抑瘤率+埃克替尼組抑瘤率)/(埃克替尼組抑瘤率+聯合組抑瘤率-埃克替尼組抑瘤率×聯合組抑瘤率)×100%；結果判定：Q＞1為增效，Q=1為相加，Q＜1為無效。

1.2.4 免疫組化法檢測Fas、Bax的表達：免疫組化采用SP法，參照SP法常規步驟操作。結果判斷：Fas定位于細胞膜，Bax定位于胞漿，分別以胞膜、胞漿出現棕黃色顆粒為陽性細胞。采用雙盲法，觀察切片至少5個具有代表性的高倍視野，拍攝照片，使用Image-Pro Plus 6.0對免疫組化結果進行評估，得到每個樣本平均光密度值（MOD），計算每組標本的平均MOD值，代表該組移植瘤該蛋白的相對表達量。

1.2.5 Western Blot法檢測CyclinD1的表達：取各樣本腫瘤組織，分別制成細胞勻漿，進行檢測。根據蛋白提取試劑盒說明書操作提取細胞總蛋白。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白定量。經12%SDS-PAGE電泳后轉膜。脫脂奶粉封閉，CyclinD1一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h，ECL孵育3～5min。暗室中用X膠片感光、顯影、定影。采用GAPDH蛋白表達作為內參照，采用Image J掃描軟件掃描WB條帶得到CyclinD1灰度值，該灰度值和GAPDH的灰度值的比值即為CyclinD1表達的相對值。

2 實驗結果

2.1 扶正祛積湯對埃克替尼抑制肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的影響：灌胃第21天埃克替尼組與扶正祛積湯組抑瘤率之和＜聯合組抑瘤率，聯合組增效率=111.11%，增效率＞1，說明扶正祛積湯對埃克替尼有增效的作用，扶正祛積湯聯合埃克替尼后能協同增效抑制移植瘤生長。見表1。

表1 各組裸鼠移植瘤抑瘤率變化（%，n=20）

2.2 扶正祛積湯聯合埃克替尼對肺裸鼠移植瘤Fas、Bax表達的影響：各組裸鼠移植瘤指標免疫組化MOD值見表2。Fas組化染色結果見圖1，蛋白定位細胞膜，在細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性細胞。聯合組瘤組織Fas蛋白的MOD明顯高于埃克替尼組、扶正祛積湯組和模型組（P＜0.05）。Bax組化染色結果見圖2，蛋白定位于細胞漿，在細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性細胞。聯合組瘤組織Bax蛋白的MOD要明顯高于埃克替尼組、扶正祛積湯組和模型組（均P＜0.05）。

表2 各組裸鼠移植瘤Fas和Bax蛋白MOD值（±s，n=20）

表2 各組裸鼠移植瘤Fas和Bax蛋白MOD值（±s，n=20）

注：與聯合組比較，*P＜0.05。

組別模型組埃克替尼組扶正祛積湯組聯合組Bax 264875.14±106540.22*355662.01±193885.64*338772.29±165312.96*45632.26±24039.97 Fas 29510.90± 8443.14*412833.80±136696.20*42273.35±23462.76*472656.87±149156.91

模型組 埃克替尼組 扶正祛積湯組

圖1 各組裸鼠移植瘤組織Fas染色（SP法，200倍）

模型組 埃克替尼組 扶正祛積湯組

圖2 各組裸鼠移植瘤組織Bax染色（SP法，200倍）

2.3 扶正祛積湯聯合埃克替尼對肺移植瘤cyclinD1表達的影響：各組移植瘤組織cyclinD1蛋白表達見圖3。模型組、埃克替尼組、扶正祛積湯組和聯合組的CyclinD1蛋白表達相對值（CyclinD1/GAPHD）分別為0.39±0.10、0.30±0.093、0.32±0.13和 0.22±0.064。聯合組cyclin D1表達水平明顯低于埃克替尼組（P＜0.05）、扶正祛積湯組（P＜0.05）和模型組（P＜0.01）。

圖3 各組裸鼠移植瘤cyclinD1蛋白表達

3 討論

進展期NSCLC多為氣陰兩虛，邪積多為痰、瘀、熱毒，扶正祛積湯治療以益氣養陰、化痰祛瘀為主，藥用南沙參、北沙參、太子參、麥冬、天冬、鮮石斛益氣養陰，制半夏、浙貝、米仁、萊菔子、莪術化痰祛瘀，貓爪草、黃芩、魚腥草、野蕎麥根清熱解毒，全方攻補兼施，祛邪不傷正，補虛不留邪。本實驗結果顯示，聯合組增效率為111.11%，說明扶正祛積湯聯合埃克替尼對肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的抑瘤效果明顯強于埃克替尼組。聯合組Fas的表達明顯高于埃克替尼組（P＜0.05），可以明顯抑制移植瘤的增殖，說明扶正祛積湯可以進一步提高埃克替尼引起的Fas的表達水平而增加抑瘤效果。聯合組瘤組織Bax表達水平要明顯高于埃克替尼組（P＜0.05），提示扶正祛積湯可以進一步提高埃克替尼引起的Bax的表達水平，這可能和兩者協同抑制移植瘤的增殖有關。聯合組移植瘤組織cyclin D1的表達水平顯著低于埃克替尼組（P＜0.05），提示扶正祛積湯可以進一步降低埃克替尼引起的cyclinD1的表達下降，協同埃克替尼抑制腫瘤細胞的分裂增殖。

綜上，扶正祛積湯可以提高埃克替尼對肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，扶正祛積湯的協同增效抑瘤機制可能和提高Fas、Bax表達水平和降低CyclinD1的表達水平有關。當然，本研究還存在不足，例如未能深入研究扶正祛積湯聯合埃克替尼抑制肺癌細胞增殖的信號通路機制，Fas和Bax使用了免疫組化未使用半定量的Western blot等，未檢測細胞周期分布和細胞凋亡等，這些均有待于進一步研究和完善。