敦煌地區(qū)產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選鑒定及其發(fā)酵條件研究*

周 璇 牛世全 鄭豆豆 王 彥 朱學(xué)泰 孔維寶 張愛梅

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070）

微生物胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是指微生物在生長代謝過程中分泌到培養(yǎng)基中的大分子聚合物［1］。近年來，微生物胞外多糖以其生長周期短、安全性高、理化性質(zhì)獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工、環(huán)保等領(lǐng)域［2-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界微生物多糖年加工產(chǎn)值可達(dá)80 億美元左右［4］。 雖然到目前為止有49屬76種微生物能夠產(chǎn)生胞外多糖［5］，但是真正投入工業(yè)化生產(chǎn)的胞外多糖只有黃原膠（xanthan）、結(jié)冷膠（gellan）、普魯蘭（pullulan）、熱凝多糖（curdlan）、鼠李膠（rhamsan）等10 余種［6］。 因此，開發(fā)具有應(yīng)用價值的新型微生物胞外多糖是目前世界上亟待解決的問 題［7-8］。

極端環(huán)境是潛在的、 重要的微生物資源庫之一。 極端環(huán)境下微生物所產(chǎn)生的胞外多糖在多樣性和功能上更具優(yōu)勢， 已經(jīng)成為近幾年新的研究熱點(diǎn)［9］。趙惠婭等［10］從600 余株南極微生物中篩選出2 株可產(chǎn)生顯著提高大菱鲆免疫活性的胞外多糖的極地菌株20#3 和3-3-1-2， 為極地胞外多糖作為水產(chǎn)動物飼料添加劑提供一定的基礎(chǔ)資料；龍寒等［11］從廣西北部灣分離得到一株產(chǎn)EPS 的海洋弧菌， 并發(fā)現(xiàn)該EPS 對腫瘤細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用。 鹽堿土壤是極端環(huán)境的一種，鹽堿土壤中微生物所產(chǎn)胞外多糖同樣也具有多種優(yōu)良特性。 艾雪等［12］從柴達(dá)木盆地荒漠鹽土中分離出19株耐鹽堿細(xì)菌， 并發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)胞外多糖對沙漠化防治及改善荒漠生態(tài)環(huán)境有極大應(yīng)用價值；高爽等［13］分離得到的一株中度嗜鹽菌Halomonas sp.H09 所產(chǎn)胞外多糖在玉米淀粉加工企業(yè)廢水的處理中，添加量少、絮凝熱穩(wěn)定性較好，具有較高的應(yīng)用優(yōu)勢；Juan Antonio Mata 等［14］從西班牙南部Jaén 地區(qū)鹽堿土壤中分離得到菌株H. ventosae Al12 T 和Al16 所產(chǎn)胞外多糖具有較強(qiáng)的結(jié)合陽離子的能力， 在治理重金屬離子的污染等方面有著深遠(yuǎn)的意義；Ruiz-Ruiz 等［15］分離得到的一株嗜鹽菌所產(chǎn)EPS 經(jīng)硫酸化后具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，為癌癥的治療提供理論依據(jù)。

敦煌地區(qū)位于河西走廊的最西端， 常年干旱少雨，水分蒸發(fā)量較大，土壤鹽堿化嚴(yán)重，是一類典型的極端環(huán)境。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，河西走廊鹽堿土壤中微生物多樣性非常豐富， 存在大量的微生物類群［16］，但目前對于河西走廊產(chǎn)胞外多糖的細(xì)菌研究未見報導(dǎo)。 因此河西走廊可作為產(chǎn)具有應(yīng)用價值的胞外多糖微生物的潛在菌源地， 有待進(jìn)行進(jìn)一步探究。 本文對從敦煌地區(qū)鹽堿土壤中分離的一株胞外多糖產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行了篩選及鑒定，同時優(yōu)化了該菌株的產(chǎn)糖培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 菌種分離源 樣品采自敦煌地區(qū)鹽堿土壤。

1.2 培養(yǎng)基 菌株初篩用LB 固體培養(yǎng)基， 種子液用LB 液體培養(yǎng)基，菌株復(fù)篩用發(fā)酵培養(yǎng)基［17］。

1.3 菌株初篩 稱取土樣5 g， 放入已滅菌的裝有45 mL 蒸餾水的三角瓶中，振蕩均勻后稀釋6 個梯度； 取50 μL 10-4、10-5、10-6梯度土壤懸浮液涂布于LB 培養(yǎng)基上，28℃恒溫倒置培養(yǎng)48～72 h；挑取在LB 培養(yǎng)基上能產(chǎn)生大量粘稠物質(zhì)的單菌落，反復(fù)劃線純化后，接種于斜面培養(yǎng)基中于4℃冰箱中保存。

1.4 菌株復(fù) 篩［18-20］

1.4.1 苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定［20］稱取10 mg葡萄糖于100 mL 容量瓶中配制成100 μg／mL 的葡萄糖溶液。 分別取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL 配制好的葡萄糖溶液于潔凈干燥的試管中，加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，配制成不同濃度的葡萄糖溶液。 在不同濃度的葡萄糖溶液中分別加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，靜置10 min 后振蕩搖勻，室溫靜置20 min 后，測定其在490 nm 處的吸光值。 取2.0 mL 蒸餾水作為空白對照。 以490 nm 處吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。 通過苯酚硫酸法確定了總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.01115x+0.23192，R2=0.9974。

1.4.2 粗多糖的分離 將初篩得到的菌株接種到含有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，28℃、160 r／min 培養(yǎng)24 h 制成種子液。 將發(fā)酵好的種子液以5%（v/v） 的接種量接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中， 培養(yǎng)48 h 后將發(fā)酵液煮沸滅活，10 000 r／min 離心10 min，取10 mL 上清液，加入3 倍體積95 %乙醇，用力振蕩至產(chǎn)生絮狀沉淀后，4 ℃沉淀過夜。 再經(jīng)過10 000 r／min 離心10 min 后棄上清液，所得沉淀烘干，加入少量蒸餾水溶解，定容至10 mL。 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用苯酚硫酸法測定多糖含量， 選取胞外多糖產(chǎn)量最高的菌株作為目標(biāo)菌株。

1.4.3 多糖含量測定［20］將按照1.4.2 操作所得的粗多糖溶液稀釋10 倍，取2 mL 稀釋后的多糖溶液于試管中， 分別加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，靜置10 min 后振蕩搖勻，室溫靜置20 min，測定其在490 nm 處的吸光值，并參照回歸方程求出總糖含量。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 生理生化測定及形態(tài)學(xué)鑒定 將目標(biāo)菌株劃線接種于LB 培養(yǎng)基上，28℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特點(diǎn)，通過革蘭氏染色和芽孢染色對菌體形態(tài)進(jìn)行觀察，并參考東秀珠等［21］的方法進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5.2 16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（Omega bio-tek，America）提取細(xì)菌DNA，以27F和1492R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 反應(yīng)體系如下：12.5 μL 2×Taq mix，7.5 μL 去離子水，4 μL 模板DNA，引物各1 μL，總體積25 μL。PCR 反應(yīng)體系組成為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，30 個循環(huán)；72℃終延伸5 min。

產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。 所得序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫比對，采用MEGA 4.0 繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 最佳培養(yǎng)基優(yōu)化

1.6.1 粗多糖分離與多糖含量測定 將粗多糖溶液稀釋100 倍后用苯酚硫酸法測定多糖含量，粗多糖的分離與多糖含量測定同1.4。

1.6.2 單因素實(shí)驗(yàn) 為提高產(chǎn)糖量，通過設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，28℃160 r／min 振蕩培養(yǎng)48 h 后測定產(chǎn)糖量，選擇發(fā)酵因子中的最佳水平。

1.6.3 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選 從敦煌地區(qū)鹽堿土壤中初篩共得到的18 株產(chǎn)多糖的菌株， 經(jīng)編號并通過苯酚硫酸法測定多糖含量，結(jié)果表明，菌株Ⅱ4-01 胞外多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到0.846 g／L。 選取菌株Ⅱ4-01 作為目標(biāo)菌株。初篩所得18 株菌株胞外多糖產(chǎn)量如表2 所示。

表2 18 株菌株的胞外多糖產(chǎn)量

2.2 菌株鑒定 菌株Ⅱ4-01 在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后， 呈現(xiàn)白色不透明的單菌落， 表面粗糙皺褶，邊緣不整齊，菌落直徑約為3 mm。 革蘭氏染色后呈陽性，芽孢染色后呈橢圓形，芽孢中生。 菌株Ⅱ4-01 可水解淀粉和纖維素，可利用檸檬酸鹽，可分解色氨酸形成吲哚， 能分解葡萄糖產(chǎn)生乙酰甲基甲醇；對碳源的利用結(jié)果表明，菌株Ⅱ4-01 能利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、甘油，不能利用精氨酸（表3）。

表3 菌株Ⅱ4-01 的生理生化特征

經(jīng)PCR 對16S rDNA 擴(kuò)增得到片段長度約為1 450 bp 左右的序列， 測序后與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast 比對。 結(jié)合菌株Ⅱ4-01 的形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定結(jié)果，進(jìn)一步證明菌株Ⅱ4-01 為一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 不同碳源對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響碳源是提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)來源。除水分外，微生物需要量最大的營養(yǎng)物為碳源，碳源也決定微生物所產(chǎn)多糖的質(zhì)量和數(shù)量［22］。對不同碳源的利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 菌株Ⅱ4-01 對6 種碳源均可利用，不同碳源條件下胞外多糖產(chǎn)量為：蔗糖＞淀粉＞葡萄糖≈玉米粉＞麥芽糖＞甘油，以蔗糖為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源時菌株Ⅱ4-01 的胞外多糖產(chǎn)量高達(dá)4.218 g／L（圖2），因此確定蔗糖為最佳碳源。

2.3.2 不同氮源對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響

氮源能提供微生物生長所必須的核苷酸、維生素合成所需的營養(yǎng)物質(zhì)。 不同氮源對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響如圖2 所示，菌株Ⅱ4-01 對黃豆粉的利用能力明顯高于其他氮源， 因此選擇黃豆粉為最佳氮源。

2.3.3 不同無機(jī)鹽對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響 無機(jī)鹽是維持微生物生長代謝不可或缺的物質(zhì)，其功能主要是參與菌體的構(gòu)成、作為酶的組成部分、調(diào)節(jié)滲透壓等［19］。 由圖2 可知，向培養(yǎng)基中添加相同濃度的KCl、NaCl、MnCl2、CaCl2時， 菌株Ⅱ4-01 的EPS 產(chǎn)量并沒有明顯波動，而添加MgSO4時菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量明顯高于添加其他4 種無機(jī)鹽的產(chǎn)量。

2.3.4 蔗糖濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響碳源濃度對多糖產(chǎn)量影響較大，碳源濃度適宜時，菌株才能正常生長并產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物［12］。 將蔗糖濃度設(shè)置為1%、2%、3%、4%，探究碳源濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3a 所示，隨著蔗糖濃度的增加，EPS 產(chǎn)量逐漸升高，濃度為2%時增加明顯。 考慮到經(jīng)濟(jì)因素，加之碳源濃度從2%～4%時，EPS 產(chǎn)量并未顯著增加， 因此確定最佳蔗糖濃度為2%。

2.3.5 黃豆粉濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響 氮源濃度對EPS 產(chǎn)量的影響如圖3a 所示。隨著氮源濃度增加，菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢， 當(dāng)?shù)礉舛葹?%時，EPS 產(chǎn)量最高，達(dá)到4.801 g／L。

2.3.6 MgSO4濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響將MgSO4濃度設(shè)置0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07% 5 個梯度。 由圖3b 可知，隨著MgSO4濃度的增加，EPS 產(chǎn)量先升高后降低，當(dāng)MgSO4濃度為0.05%時，EPS 產(chǎn)量達(dá)到5.359 g／L。

2.3.7 培養(yǎng)基pH 對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的影響 pH 對微生物生長和代謝途徑都有很大影響。將上述優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 調(diào)整為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，pH 對 菌 株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn) 量 的影響如圖4 所示。 當(dāng)培養(yǎng)基中初始pH 在5.0～8.0時， 菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量逐漸增加，pH 為8.0時，產(chǎn)糖量達(dá)到最大，為5.56 g／L。 當(dāng)pH 超過8.0以后，產(chǎn)糖量逐漸下降。

2.4 正交實(shí)驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)， 設(shè)計(jì)4 個因素3 個水平，采用L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表4）。由極差分析可知， 對EPS 產(chǎn)量影響最大的因素排序?yàn)椋禾荚礉舛龋ˋ）＞pH（D）＞無機(jī)鹽濃度（C）＞氮源濃度（B），因此，在培養(yǎng)條件相同的情況下，碳源濃度對菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量的貢獻(xiàn)最大。 由表4 可知， 菌株Ⅱ4-01 EPS 產(chǎn)量最高的最佳培養(yǎng)基組合為：A3B3C2D1，即最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖25.0 g／L，黃 豆 粉25.0 g／L，MgSO40.5 g／L，Na2HPO4·12H2O 2 g／L，NaH2PO4·2H2O 1 g／L，pH=7.5。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 生長曲線分析 經(jīng)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每隔12 h 取1 次樣，測定EPS 產(chǎn)量和生物量。結(jié)果如圖5 所示，菌株Ⅱ4-01 在24 h 前為對數(shù)期，24 h 后為穩(wěn)定期，生物量在36 h 達(dá)到最大，此時菌株EPS 產(chǎn)量也達(dá)到最大，為8.594 g／L。36 h 后，菌株Ⅱ4-01 進(jìn)入衰亡期，生物量和EPS 產(chǎn)量也逐漸下降。 由圖中曲線可知，菌株Ⅱ4-01 生物量和EPS 產(chǎn)量基本上成正比。因此，選擇36 h 為菌株Ⅱ4-01 多糖的最佳收取時間。

3 討論

由于極端環(huán)境的微生物具有特殊的生理機(jī)能、基因類型和代謝產(chǎn)物，蘊(yùn)藏著極大的科學(xué)和應(yīng)用價值，因此成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［23］。從海洋、南極等地獲得的胞外多糖樣品是目前對極端環(huán)境下胞外多糖研究炙手可熱的方向之一。 從海洋、南極等地分離得到的胞外多糖樣品將有可能成為人類治療腫瘤、心血管疾病等的重要藥用資源［24］。 但是目前對鹽堿土壤下的微生物胞外多糖的研究報導(dǎo)較少，F(xiàn). Moshabaki Isfahani 等［25］在高鹽環(huán)境下分離得到3 株產(chǎn)EPS 菌株B. aerus ATHM35，A.luteolus ATHM36 和H. eurihalina ATHM 37，其中H.eurihalina ATHM 37 產(chǎn)糖量最高，為0.277 g／L；Juan Antonio Mata 等［14］從西班牙南部Jaén 地區(qū)鹽堿土壤中分離得到菌株H. ventosae Al12 T 和Al16，在最佳培養(yǎng)條件下， 其產(chǎn)糖量分別為0.2835 g／L和0.2895 g／L， 此外還從西班牙馬拉加省的內(nèi)陸濕地Fuente de Piedra 鹽堿土壤中分離得到菌株H.anticariensis FP35T 和FP36，其在最優(yōu)條件下其產(chǎn)糖量分別為0.4360 g／L 和0.5095 g／L；Amjres等［26］分離得到的一株嗜鹽菌在最佳培養(yǎng)條件下產(chǎn)糖量為3.89 g／L。 與上述研究相比，菌株Ⅱ4-01EPS在產(chǎn)量方面優(yōu)勢明顯，開發(fā)和應(yīng)用研究價值突出。

芽孢桿菌屬菌株能產(chǎn)生多種EPS，例如，果聚糖、β-1，3-葡聚糖和主要由中性糖組成的雜聚物， 以及糖醛酸或糖蛋白結(jié)合物等。 相關(guān)研究表明，一些分離自芽孢桿菌的EPS 顯示出優(yōu)異的乳化、絮凝、重金屬去除能力或藥物活性［27］。 王正榮等［28］從沙漠結(jié)皮中分離得到的一株芽孢桿菌所產(chǎn)胞外多糖具有較強(qiáng)的絮凝活性；袁建鋒等［29］篩選得到的一株芽孢桿菌所產(chǎn)胞外多糖在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中顯示出較強(qiáng)的抗氧化性， 并且對脂質(zhì)過氧化有抑制作用， 是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑；Ruiz-Bravo A 等［30］研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株芽孢桿菌所產(chǎn)胞外多糖具有免疫調(diào)節(jié)特性，能在體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖。 但是，目前對于地衣芽孢桿菌的研究主要集中在微生態(tài)制劑［31］或益菌素的生產(chǎn)［32］，對胞外多糖的研究相對較少。 彭愛銘等［33］研究了1 株產(chǎn)EPS 的地衣芽孢桿菌TS-01 的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)該菌株在最優(yōu)條件下產(chǎn)糖量為3.65 mg/mL，本實(shí)驗(yàn)室分離得到的菌株Ⅱ4-01 在最佳培養(yǎng)基中，即在蔗糖25.0 g／L， 黃豆粉25.0 g／L、MgSO40.5 g／L、Na2HPO4·12H2O 2 g/L、NaH2PO4·2H2O 1 g／L、pH＝7.5的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)36 h 后，產(chǎn)糖量為8.594 g/L，明顯優(yōu)于菌株TS-01。此外，彭愛銘等［33］發(fā)現(xiàn)菌株TS-01 所產(chǎn)EPS 在一定濃度下清除自由基能力顯著， 同時能增強(qiáng)T、B 淋巴細(xì)胞的增殖， 結(jié)合Chunhui Liu 等［27］從中國濟(jì)南附近某果園土樣中分離得到的地衣芽孢桿菌8-37-0-1 的胞外多糖能顯著刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖這一研究結(jié)果，本研究分離得到的菌株Ⅱ4-01 所產(chǎn)EPS 是否具有同樣的免疫學(xué)活性值得深究。

與此同時這些研究也表明， 現(xiàn)有對鹽堿環(huán)境下產(chǎn)糖微生物的研究主要集中在產(chǎn)EPS 菌株的篩選、EPS 的提取等方面，對于鹽堿環(huán)境下分離得到的EPS 是否具有重要的生物功能和藥用價值還需進(jìn)一步研究和開發(fā)。 另外還有一些研究表明細(xì)菌EPS 能結(jié)合鈉離子并降低其在土壤中的毒性［34］，因此，敦煌地區(qū)分離得到的細(xì)菌EPS 能否改善土壤鹽堿化程度也值得進(jìn)行深入研究。