續苓健骨方對去卵巢骨質疏松模型大鼠血液鈣磷代謝的影響

陳賽楠 吳華嵩 程佑民 葉云金 李生強 謝麗華 陳娟 葛繼榮

福建省中醫藥研究院骨質疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州 350003

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)屬Ⅰ型高轉換型原發性骨質疏松癥，是由于絕經后卵巢功能衰退、雌激素水平降低引起的骨吸收亢進，進而骨重建失衡導致骨量降低、骨微結構破壞、骨折風險性增加的全身性骨骼疾病[1]。隨著人口老齡化程度加劇，其發病率逐年上升，骨折致畸、致殘是最常見且最嚴重的并發癥，嚴重影響老年人的生活質量[2]。骨質疏松癥病因多與性別、營養、內分泌、遺傳等因素密切相關[3]，其發病機制較為復雜，鈣代謝紊亂是重要的病理機制之一[4]，因此糾正機體負鈣代謝是防治PMOP的有效措施之一。

中醫理論認為骨質疏松癥的發生與腎、脾關系密切，腎主骨生髓，腎精虧虛不足以充養骨髓，“腎為先天之本”“脾為后天之本”，腎脾相互影響，互為因果。腎虛可致脾虛，脾失運化，脾氣不足，則骨髓空虛、骨骼失養而成骨痿。續苓健骨方是葛繼榮教授長期致力于骨質疏松癥中藥新藥臨床試驗并結合臨床實踐，依據補腎壯骨、益氣健脾、活血祛瘀而提出的指導用藥，是治療絕經后骨質疏松癥腎虛血瘀證的中藥驗方，辨證論治、整體調控，可有效提高患者骨密度、緩解臨床癥狀。為進一步探討其治療機制，本實驗采用雙側卵巢切除術建立大鼠骨質疏松模型，觀察續苓健骨方對大鼠脛骨骨密度、脛骨組織顯微結構、骨代謝指標TRAP、血鈣和血磷含量的影響，探討續苓健骨方防治絕經后骨質疏松癥的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級3月齡未孕雌性SD大鼠40只，體重(240±10)g，購自上海禹堃實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2016-0003。實驗動物飼養于福建省中醫藥研究院比較醫學中心，合格證號：醫動學第23-016號。

1.1.2 實驗藥物：續苓健骨方由骨碎補、茯苓、白術、陳皮、赤芍和甘草等12味中藥組成，每劑總重量122 g，購自福建鷺燕中宏醫藥有限公司；碳酸鈣D3片(Ⅱ)，規格：鈣500 mg、維生素D3200 IU，北京康遠制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20093675，批號：20170328。

1.1.3 主要試劑與儀器：戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich)、多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)、乙二胺四乙酸二鈉(國藥集團化學試劑有限公司)、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天生物技術)、鈣測試盒(南京建成生物工程研究所)、磷測試盒(南京建成生物工程研究所)、酶標儀(BIO-TEK,LX-800)、雙能X線骨密度儀(HOLOGIC,Discovery WS/N 89006)、組織脫水機(亞光,ZT-14V2)、石蠟包埋機(亞光,YB-7LF)、石蠟切片機(Leica,RM2255)、玻片數字掃描儀(3D HISTECH,Pannoramic 250,Pannoramic MIDI)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備：SD大鼠飼養至6月齡，隨機分為假手術組、骨質疏松模型組、續苓健骨方組、碳酸鈣組，每組10只。除假手術組外，其余組行雙側卵巢切除術制備模型[5]。術前一天禁食不禁水，稱重，2%戊巴比妥鈉按0.2 mL/100 g劑量行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，備皮，于腹部正中線作一長約1.5 cm的切口。沿腹白線打開腹腔，沿Y型子宮尋找雙側粉紅色桑葚狀卵巢，結扎，徹底摘除卵巢，逐層縫合，術后肌注青霉素8萬單位，連續3 d。假手術組采用相同手術方法，切除卵巢附近相等量脂肪組織。

1.2.2 藥物干預：于術后4周進行藥物干預，大鼠灌胃劑量根據實驗動物體表面積換算，續苓健骨方組灌胃劑量為12.71 g/(kg·d)，碳酸鈣組灌胃劑量為104.19 mg/(kg·d)，假手術組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續灌胃12周，于灌胃結束后取材。

1.2.3 血清生化：行腹主動脈采血，全血靜置2 h，3 000 r/min、離心10 min。吸取血清，嚴格按照抗酒石酸酸性磷酸酶、鈣、磷測試盒說明書操作，酶標儀測定樣本吸光度，繪制標準曲線，計算血清抗酒石酸酸性磷酸酶、鈣、磷含量。

1.2.4 骨密度測量：取左側脛骨，盡量去除肌肉、周圍軟組織，用生理鹽水沾濕紗布包裹保存，固定位置。雙能X線骨密度儀采用小動物掃描模式，自選工具選定ROI區域，讀取樣本骨密度，打印測量結果。

1.2.5 病理學觀察：取右側脛骨置4%多聚甲醛中常溫固定48 h，10% EDTA(pH 7.2～7.4)脫鈣，每3日更換一次，常溫脫鈣6周至刀切無阻力感。水洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，脛骨冠狀面為切面，4 μm厚連續切片，60 ℃拷片2 h，切片脫蠟至水，Bouin’s固定液固定1 h，水洗至無色，麗春紅染液染色10 min，水洗，磷鉬酸分色鏡下控制，固綠染液染色3 min，水洗，中性樹脂封片，玻片明場全視野掃描，觀察骨組織顯微結構。

1.3 統計學分析

圖1 脛骨近端冠狀面(Masson染色，×0.7、×100)(黑色箭頭：骨骺線)Fig.1 The coronal plane of proximal tibia (Masson staining, ×0.7, ×100)

2 結果

2.1 骨密度

與假手術組相比，模型組脛骨骨密度顯著降低(P<0.01)，提示絕經后骨質疏松癥模型復制成功；與模型組相比，續苓健骨方組骨密度提高(P<0.05)，碳酸鈣組骨密度略有提高，但差異不具有統計學意義；結果顯示續苓健骨方的藥效作用，見表1。

2.2 病理學觀察

脛骨Masson染色可見假手術組骨骺線(黑色箭頭)下骨小梁量多、緊密，排列規則、分布均勻，骨小梁間距小，相互連接成網狀，骨髓腔未見明顯脂滴聚集(圖1 A)。模型組可見骨小梁稀疏，排列不規則、分布不均勻，骨小梁間距顯著增加，可見骨小梁斷點，骨小梁丟失部位以髓腔正中最為顯著、依次向腓骨側擴散，骨髓腔內可見脂滴顯著增加(圖1B)。與模型組相比，續苓健骨方組骨小梁數量增加，分布較均勻，骨小梁間距縮小，髓腔內脂滴數量較少(圖1C)；碳酸鈣組骨小梁疏松程度介于模型組和續苓健骨方組之間，骨組織結構達到一定程度的改善(圖1D)。

組別BMD假手術組0.4168±0.0212**模型組0.3321±0.0101##續苓健骨方組0.3671±0.0135*碳酸鈣組0.3494±0.0149##統計值0.000

注：與假手術組相比，#P<0.05;與假手術組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05;與模型組相比，**P<0.01。

于骨骺線下中央部位鏡下(×50)計算骨小梁面積，與假手術組相比，模型組骨小梁面積顯著降低(P<0.01)；與假手術組相比，續苓健骨方組(P<0.01)、碳酸鈣組(P<0.05)骨小梁面積上升，見表2。

表2 大鼠脛骨骨小梁面積Table 2 Results of tibia trabecular area in the rats

注：與假手術組相比，#P<0.05;與假手術組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05;與模型組相比，**P<0.01。

2.3 血清生化

與假手術組相比，模型組TRAP活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，續苓健骨方組TRAP活性降低(P<0.05)，碳酸鈣組TRAP活性稍降低，但差異沒有統計學意義。結果顯示續苓健骨方可降低破骨細胞活性，降低骨吸收量。與假手術組相比，模型組血鈣降低(P<0.05)、血磷升高(P<0.05)；與模型組相比，續苓健骨方組血鈣升高(P<0.05)、血磷降低(P<0.05)，碳酸鈣組血鈣稍升高、血磷稍降低，但差異沒有統計學意義。結果顯示續苓健骨方在一定程度上恢復了鈣磷代謝穩態。見表3。

組別TRAP血鈣血磷假手術組 24.8685±3.6685**2.5728±0.3534*2.5945±0.2061*模型組 34.8856±7.5827##2.278±0.0786#2.9519±0.2183#續苓健骨方組28.8877±4.5355#*2.4163±0.2263*2.6125±0.3278*碳酸鈣組 31.6902±5.1974#2.361±0.11482.7156±0.4323統計值 0.0070.0210.066

注：與假手術組相比，#P<0.05;與假手術組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05;與模型組相比，**P<0.01。

3 討論

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)中以絕經后骨質疏松癥多見，鈣磷代謝紊亂是重要病理機制之一。鈣是人體的必需元素，99%的鈣以羥磷灰石結晶的方式儲存于骨組織中，1%的鈣分布于體液和軟組織中，兩者處于動態平衡；游離鈣是重要的第二信使，參與凝血、肌肉收縮等重要生理過程[6-7]。磷也是人體的必需元素，86%的磷以磷酸鈣形式存儲于骨組織中，14%的磷分布于細胞中，是核酸、三磷酸腺苷和骨骼等組織的重要組成部分，參與并維持機體正常生理功能。磷需協同鈣和維生素D共同維持其正常的生理功能[8]。機體內存在精細的鈣磷平衡調節機制，腸、腎、骨是調控鈣磷代謝的主要靶器官[9]，1,25(OH)2D3[10]、甲狀旁腺素(PTH)[11]、降鈣素(CT)[9]是調控鈣磷代謝的主要激素，協同調控血鈣磷吸收、尿鈣磷重吸收與排泄、骨鈣磷沉積與釋放，共同維持機體內的鈣磷代謝平衡。

雌激素是重要的骨代謝調控激素，對鈣磷代謝起著重要的調控作用[12]。雌激素對骨組織的主要作用是抑制骨吸收，作用一為促進1,25(OH)2D3合成，增加腸鈣吸收，有利于骨鈣沉積；作用二是降低機體對PTH的敏感性，降低升鈣降磷作用，抑制骨吸收；作用三是促進CT分泌，抑制破骨細胞活動，降低骨鈣釋放入血。絕經后雌激素水平急速降低，1,25(OH)2D3合成降低，PTH敏感性升高，CT抑制破骨細胞作用減弱，引起的腸鈣吸收減少，尿鈣重吸收率降低、排泄增加，骨吸收和骨形成失衡，骨重建呈高轉化，骨吸收、骨形成均增強，但骨吸收作用強于骨形成作用。正常人血清鈣磷乘積是35～40，鈣磷比值影響骨代謝[13]；血清鈣與血清磷呈負相關，血清鈣降低則血清磷升高，血清鈣升高則血清磷降低；低鈣高磷引起PTH分泌增加，導致骨吸收作用加強、骨重建紊亂，從而影響骨密度[14]。

中醫將骨質疏松癥歸“骨痿”“骨枯”范疇，病變在骨，病位在腎，與肝脾胃緊密相關。腎精虧虛、脾胃虛弱、氣滯血瘀為主要病機，采用補腎填精、健脾和胃、活血散瘀的治則，選用續苓健骨方為臨床治療絕經后骨質疏松癥腎虛血瘀證驗方，以續斷、骨碎補為君藥，補肝腎強筋骨;白術、茯苓、陳皮為臣藥，益氣健脾;配赤芍清熱涼血、女貞子等為佐藥，滋陰補腎;甘草為使藥，調和藥性。共奏補腎壯骨、益氣健脾、活血通絡止痛之功效。本實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組骨小梁數量顯著下降，血鈣降低而血磷升高，鈣磷代謝紊亂，呈負鈣平衡狀態；經續苓健骨方干預12周后，血鈣升高而血磷降低，經雙能X線骨密度儀測量顯示骨密度升高，且經Masson染色顯示骨小梁數量和分離度具有了改變。結果表明本方在一定程度上糾正了負鈣平衡，恢復了鈣磷穩態，下調了骨重建速率以改善去卵巢大鼠骨質疏松狀況。藥理研究表明，章軼立等[16]篩選出骨碎補治療OP的4個關鍵作用靶標：甲狀旁腺素1受體(PTH1R)、甲狀旁腺素2受體(PTH2R)、降鈣素受體基因(CALCR)、SPTBN1基因(SPTBN1)[15]；白術提取物(AMK)可通過調節小腸上皮細胞(IEC-6)發揮黏膜保護和修復作用；茯苓多糖對腸道黏膜免疫系統具調節作用[17]；女貞子粗提物可促進維生素D受體和鈣結合蛋白表達，促進腸鈣吸收，抑制尿鈣排泄[18]。單純碳酸鈣D3片(Ⅱ)的治療對骨量影響較為有限，不能預防50歲以上人群骨折的發生[19]。補鈣屬于骨質疏松癥的基礎治療，應根據骨質疏松癥的類型，選用雙膦酸鹽類[20]、選擇性雌激素受體調節劑[21]、PTH[22]等藥物共同進行治療。

本實驗結果初步顯示了續苓健骨方能夠通過調控鈣磷代謝從而提高去卵巢大鼠骨密度并改善骨組織微結構，但如何調控鈣磷代謝，是否通過促進腸鈣吸收、降低尿鈣排泄、促進骨鈣沉積等問題，還需后續進一步深入研究來探討其調控機制，為續苓健骨方的臨床應用提供實驗基礎。