冰葡果醋的功能成分及抗氧化、降血糖 和降膽固醇作用

李晶，薛霖莉，郝左亮，郝林*

(1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西農業大學信息學院 食品 與環境學院，山西 晉中 030800；3.山西鱻淼酒莊有限公司，山西 晉中 030600)

冰葡萄是指將葡萄推遲采收，當氣溫低于-7 ℃使葡萄在枝上保持一段時間，在結冰狀態下采收[1]，壓榨葡萄汁作為釀制冰葡萄酒的原料，此酒被譽為葡萄酒中的極品。產生的冰葡萄皮渣中仍含有較多黃酮類和多酚類等功能性成分。釀制葡萄酒產生的皮渣約占加工總量的20%～30%[2]，其中包含約33%的果皮、65%的種子及少量的果梗。將冰葡萄皮渣釀造為冰葡果醋可以充分利用皮渣中的功能成分，也可以賦予冰葡果醋冰葡萄特有的香氣，同時避免了資源的浪費。目前，國內外對冰葡萄皮渣的開發利用甚少，且大多是普通葡萄皮渣的開發利用。鄧紅梅等將釀酒皮渣調整酒精度、糖度來釀造皮渣醋，獲得總酸5.11%的皮渣醋[3]；徐敏以山葡萄釀酒皮渣為原料，比較山葡萄皮渣醋的抗氧化活性高于市售葡萄醋[4]。文章主要測定分析了由冰葡萄皮渣和鮮食巨峰葡萄混合釀造而成的冰葡果醋中的黃酮類、多酚類、原花青素和齊墩果酸等功能成分的含量并分別進行了體外抗氧化、降血糖和降膽固醇的試驗，以期為產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

冰葡萄皮渣：山西鱻淼酒莊提供；鮮食葡萄：市售巨峰葡萄；冰葡果醋：由冰葡萄皮渣和鮮食葡萄混合釀制而成。

1.1.2 藥品與試劑

蘆丁標準品：上海藍季科技發展有限公司；ABTS 標準品：酷爾化學科技(北京)有限公司；沒食子酸標準品：廊坊市拓迪化工有限公司；α-葡萄糖苷酶：上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(PNPG)：美國Sigma公司；維生素C、原花青素、齊墩果酸、膽固醇、鄰苯二甲醛(OPA )和 DPPH 標準品：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、甲醇、正丁醇、FeSO4、H2O2、福林酚、冰乙酸、水楊酸、二甲基亞砜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-5100紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 維生素C 的測定

按照GB/T 5009.86-2003，采用2,4-二硝基苯肼比色法進行測定。繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=0.05828+0.0222X，R2=0.9987。

1.3.2 總黃酮的測定

總黃酮的測定采用比色法，按照文獻[5]的方法進行測定，以蘆丁制備標準曲線。繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=-0.20139+0.01487X，R2=0.9969。準確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.5 mL，用上述方法進行測定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計算得出總黃酮的含量。

1.3.3 總多酚的測定

總多酚的測定采用比色法，按照文獻[5]的方法進行測定，以沒食子酸制備標準曲線。繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=-0.04295+0.03939X，R2=0.9956。準確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.2 mL，用上述方法進行測定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計算得出總多酚的含量。

1.3.4 原花青素的測定

原花青素的測定采用鐵鹽催化比色法，按照文獻[6]的方法進行測定，以原花青素標準品制備標準曲線。繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=0.00221+0.02515X，R2=0.9960。準確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.1 mL，用上述方法進行測定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計算得出原花青素的含量。

1.3.5 齊墩果酸的測定

齊墩果酸的測定采用紫外分光光度法，按照文獻[7]的方法進行測定，以齊墩果酸標準品制備標準曲線。繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=0.37428+0.00222X，R2=0.9987。準確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.1 mL，用上述方法進行測定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計算得出齊墩果酸的含量。

1.3.6 DPPH·清除能力[8,9]

用1 mL的移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.5 mL于10 mL的比色試管中，加蒸餾水補足2 mL，再加入8.62×10-5mol/L的DPPH 醇溶液2 mL，混勻反應30 min，以無水乙醇作為參比在波長517 nm處測其吸光值(Ai)；用1 mL移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.5 mL于 10 mL的比色試管中，加蒸餾水補足2 mL，再加入無水乙醇2 mL，混勻反應30 min，以無水乙醇作為參比在波長517 nm處測其吸光值(Aj)；在10 mL的比色試管中加入8.62×10-5mol/L的DPPH 醇溶液2 mL，再加入無水乙醇2 mL，混勻反應30 min，以無水乙醇作為參比在波長517 nm處測其吸光值(A0)。

1.3.7 ·OH 清除能力

用1 mL的移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.6 mL，加蒸餾水補足2 mL，分別依次加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，蒸餾水2 mL，最后加入6 mmol/L H2O2啟動反應，搖勻，靜置30 min，在波長 510 nm處測其吸光值(Ai)；按上述方法，用蒸餾水代替水楊酸，測其吸光值(Aj)；按上述方法，用蒸餾水代替不同體積的樣液，測其吸光值(A0)。

用1 mL的移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.1 mL加入2.9 mL ABTS試劑中，室溫放置10 min，以蒸餾水作為參比在波長734 nm處測其吸光值(A1)；用1 mL的移液槍吸取0.1 mL 無水乙醇加入2.9 mL ABTS試劑中，室溫放置10 min，以蒸餾水作為參比在波長734 nm處測其吸光值(A0)。

1.3.9 體外降血糖[10]

用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8) 1 mmol/L PNPG，稀釋成25，50，100，150，200，300 μmol/L。分別吸取PNPG溶液各1.6 mL，加入0.2 mol/L Na2CO3溶液0.8 mL，混勻。以空白標準溶液作參比，在波長為405 nm處測其吸光度。繪制標準曲線，以確定其回歸方程。在反應體系中，加入磷酸鉀緩沖液1.12 mL，加入1×104U/mL的α-葡萄糖苷酶0.2 mL、二甲基亞砜0.08 mL，37 ℃ 恒溫孵育15 min后加入2.5 mmol/L PNPG 0.2 mL，37 ℃ 恒溫反應15 min。再加入0.08 mL濃度為0.2 mol/L的Na2CO3溶液，于405 nm波長處測定吸光值A0，對應標準曲線求得α-葡萄糖苷酶活力C0；加入α-葡萄糖苷酶同時加入等量冰葡果醋樣液，測得吸光值A1，計算得 α-葡萄糖苷酶活力C1。

1.3.10 體外降膽固醇[11]

配制1 mg/mL的膽固醇標準液，精密稱取鄰苯二甲醛10 mg，溶于冰乙酸定容至100 mL，避光保存。溶液配制時邊加濃硫酸邊振蕩，充分混勻，室溫靜置10 min，以空白標準液作參比，在波長為550 nm處測其吸光度。按表 1 進行膽固醇標準曲線的繪制，以確定其回歸方程。

表1 膽固醇標準溶液配方Table 1 The formula of cholesterol standard solution

根據表1測定標準樣品中的膽固醇含量A0，加入等量的冰葡果醋的稀釋液測得吸光度 A1，將得到的吸光值帶入上述回歸方程分別計算得出冰葡果醋中膽固醇的含量C0和C1。

不同酒精度五糧液中共檢測到的香氣物質有52種，其中醇類4種、酸類8種、酯類16種、醛類2種、芳香族類11種、內酯1種、其他6種（酮、縮醛、呋喃、含硫化合物等）、未知4種。

2 結果與分析

2.1 功能成分測定結果與分析

表2 功能成分含量Table 2 The content of functional components mg/L

由表2可知，冰葡果醋中含有維生素C 16.47 mg/L、總黃酮44.55 mg/L、總多酚20.06 mg/L、原花青素24.78 mg/L、齊墩果酸112.49 mg/L。經過發酵后維生素C含量降低，可能是在滅酶或滅菌過程中，一部分維生素C被破壞；經過發酵后總黃酮含量顯著增高，表明發酵過程促進了黃酮類化合物的合成；經過發酵后總多酚含量顯著增高，表明發酵過程有利于多酚類化合物的合成；經過發酵后原花青素含量降低，可能是在澄清過程中隨著澄清劑一起沉淀，使得原花青素有部分損失；齊墩果酸在發酵前后的含量較高，無顯著變化。

2.2 抗氧化能力

2.2.1 DPPH·清除能力

DPPH·作為一種穩定的氮中心自由基，可以清除其他的自由基，通過加入DPPH后觀察某一化學反應的速率，作為這一反應是否具有自由基反應本質的指標。根據上述公式計算得冰葡果醋中DPPH自由基清除能力達到91.68%，蘋果渣醋提取物的DPPH·清除率可達到 87.9%[12]，山葡萄皮渣醋達到71%，市售葡萄醋達到50%。表明冰葡果醋DPPH·清除能力較蘋果渣醋、山葡萄皮渣醋、市售葡萄醋都強。

2.2.2 ·OH 清除能力

羥基自由基(·OH)是最活潑的自由基，也是毒性最大的自由基，它可與活細胞中的任何分子發生反應而造成損害，且反應速度很快。根據公式計算得·OH的清除率為29.29%，清除能力較弱。山葡萄皮渣醋達到54%，市售葡萄醋達到6.9%。表明冰葡果醋·OH清除能力較山葡萄皮渣醋弱，但遠高于市售葡萄醋。

2.2.3 ABTS抗氧化能力

ABTS法測定總抗氧化能力是ABTS在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS+·，在抗氧化物存在時ABTS+·的產生會被抑制。根據方法計算ABTS+·的清除率為68.34%，總抗氧化能力較強。菠蘿皮渣果醋的ABTS+·清除率在整個發酵過程中逐漸升高，從65.3%升高到81.6%[13]。表明冰葡果醋ABTS+·清除能力較菠蘿皮渣果醋較弱，可能是由于不同原料之間抗氧化能力有差異。

2.3 體外降血糖

α-葡萄糖苷酶是促進食物分解為葡萄糖的一種酶，其抑制劑在小腸上與α-葡萄糖苷酶結合，抑制該酶的活性，使淀粉類分解為麥芽糖進而分解為葡萄糖的速度減緩，延緩食物中葡萄糖的吸收。陳樹俊等試驗表明雜糧功能醋粉具有一定的降血糖功能。測定各梯度的吸光值，制作α-葡萄糖苷酶活力的標準曲線，見圖1。得回歸方程為：Y=0.12509+0.00172X，R2=0.9919。結果表明，冰葡果醋對 α-葡萄糖苷酶有抑制作用，即有降血糖作用，計算得出抑制率為42.31%，抑制率與高鈣菊花枸杞酸奶相似[14]。

圖1 α-葡萄糖苷酶的標準曲線Fig.1 Standard curve of α-glucosidase

2.4 體外降膽固醇

膽固醇作為血脂的指標之一，是引起人類疾病的重要因素之一[15]。按照上述方法測得各梯度的吸光值，制作膽固醇測定的標準曲線，見圖2。得回歸方程為：Y=0.00701+0.00312X，R2=0.9959。測定吸光值，代入回歸方程中得濃度，并用公式計算得出冰葡果醋有降膽固醇的作用，且抑制率為14.33%。

圖2 膽固醇的標準曲線Fig.2 Standard curve of cholesterol

3 結論

冰葡果醋中維生素C、總黃酮、總多酚、原花青素、齊墩果酸的含量分別為16.47，44.55，20.06，24.78，112.49 mg/L。總黃酮和總多酚含量比釀造前原液增高，維生素C和原花青素含量比釀造前原液降低，齊墩果酸含量基本不變。

冰葡果醋對DPPH的清除能力為91.68%，對·OH的清除率為29.29%，對ABTS+·的抑制率為68.34%，對α-葡萄糖苷酶活力的抑制率為42.31%，對膽固醇的抑制率為14.33%。

綜上所述，冰葡果醋中的總黃酮和總多酚含量增高，并含有一定量的維生素C、原花青素、齊墩果酸，功能成分多樣，其對DPPH·的清除能力很強，有較強的抗氧化作用，對α-葡萄糖苷酶活力有抑制作用，具有一定的降血糖作用，對膽固醇有一定的抑制作用。