香根油的提取及抑菌性研究

楊靖，蘇海建，王劉東，閆啟峰，白冰，楊鵬飛，羅海濤

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002；2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，山東 青島 266000；3.江蘇中煙徐州卷煙廠品質(zhì)管理處，江蘇 徐州 221005； 4.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，武漢 430040；5.江西中煙工業(yè)有限 責(zé)任公司技術(shù)中心，南昌 330096)

香根草(Vetiveriazizanioides)，又名巖蘭草，是一種禾本科多年叢生的草本植物，作為經(jīng)濟(jì)植物早在20世紀(jì)50年代就由印度傳入了中國，目前國內(nèi)對香根草的開發(fā)主要集中在香根草精油的提取分析和香根草的生態(tài)應(yīng)用方面[1-8]。香根油作為一種天然香料，廣泛應(yīng)用于食品、日化和煙草中，雖然香根草有一定的藥用和保健性質(zhì)[9]，但國內(nèi)僅報道了香根草提取物對植物病原真菌的抑制作用[10]，其對細(xì)菌的抑菌性研究鮮有報道。本文采用超聲波輔助提取技術(shù)提取香根油，采用GC-MS進(jìn)行成分分析，并對其抑菌性進(jìn)行了研究，為香根草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

6890/5973N型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；KQ2200B型超聲波提取裝置 昆山市超聲儀器有限公司；LA-230S型電子天平(感量0.001 g) 北京賽多利斯儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

香根草干根：市售，產(chǎn)自廣東清遠(yuǎn)；無水乙醇、無水硫酸鈉：AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、地衣芽孢桿菌、高地芽孢桿菌：以上菌種均由鄭州輕工業(yè)學(xué)院微生物實驗室提供。

2 試驗方法

2.1 香根油的提取

將香根草干根適當(dāng)粉碎稱重，放入500 mL三角瓶中，加入適量的無水乙醇，在超聲波提取裝置中萃取，取出三角瓶，抽濾，濾液經(jīng)冷凍除蠟后在低溫條件下旋蒸除去乙醇獲得香根油。首先選擇在不同的料液比、粉碎度、時間條件下進(jìn)行單因素試驗，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，確定超聲波輔助溶劑萃取香根油的最佳條件。

2.2 GC-MS分析條件

色譜條件：HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；流量：1 mL/min；升溫程序：起始溫度60 ℃，保持2 min，以12 ℃/min升到180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升到280 ℃，保持3 min。載氣(He)流速1 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量l μL，分流比20∶1。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度190 ℃；質(zhì)量掃描范圍(m/z) 35～500，通過面積歸一化法對鑒定出的化合物進(jìn)行半定量，檢索數(shù)據(jù)庫為NIST 02。

2.3 抑菌性能研究

稱取25 g肉湯培養(yǎng)基，18 g瓊脂，加入1000 mL蒸餾水，加熱溶解后分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。用于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等的培養(yǎng)和抑菌試驗。

采用倍比稀釋法在96孔板中測定最小抑菌濃度(MIC)[11]，以一定濃度的青霉素鈉做陽性對照。在MIC測定試驗中，從無菌生長的液體培養(yǎng)基中取出20 μL涂布平板，在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落生長，無菌落生長的最小濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。MIC試驗中，為了保證精油與培養(yǎng)液的互溶性，需在培養(yǎng)液中加入1%的吐溫80做乳化劑。

3 試驗結(jié)果

3.1 料液比對產(chǎn)率的影響

準(zhǔn)確稱取60目的香根草粉末10 g，分別按照料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的比例加入無水乙醇，超聲萃取10 min，香根油的得率見圖1。

由圖1可知，香根油提取率隨著液體比例增大而提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30時，香根油提取率最高，繼續(xù)增加溶劑的量，提取效率略有降低，可能是因為溶劑過量會造成超聲作用不完全，不能將所有的細(xì)胞壁震破，而導(dǎo)致提取效率偏低，而且會增加后處理的濃縮時間，造成精油的揮發(fā)損失。

圖1 料液比對產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on extraction efficiency of vetiver oil

3.2 粉碎度對產(chǎn)率的影響

分別準(zhǔn)確稱取20，40，60，80，100目香根草粉末10 g，按照料液比1∶25加入無水乙醇，超聲萃取10 min，香根油的得率見圖2。

圖2 粉碎度對產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of mesh number on extraction efficiency of vetiver oil

由圖2可知，香根油提取率隨著粉碎度的提高而增大，但超過80目后變化不大，繼續(xù)增加目數(shù)會提高成本。

3.3 時間對產(chǎn)率的影響

準(zhǔn)確稱取60目的香根草粉末10 g，按照料液比1∶25加入無水乙醇，分別超聲萃取5，10，15，20，25 min，香根油提取率見圖3。

圖3 時間對產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of time on extraction efficiency of vetiver oil

由圖3可知，香根油提取率隨著時間的延長呈上升趨勢，當(dāng)超聲時間達(dá)到20 min時，香根油提取率最大，隨著超聲時間的繼續(xù)延長反而下降，這可能是由于超聲時間長，溶液溫度逐漸上升，對香根油揮發(fā)性有一定影響。

3.4 正交試驗

綜合單因素試驗結(jié)果，對影響超聲波萃取的主要因素進(jìn)行了三因素三水平試驗，試驗因素及水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1試驗因素及水平
Table1Theexperimentalfactorsandlevels

水平因素A料液比(g/mL)B粉碎度(目)C提取時間(min)11∶25601021∶30801531∶3510020

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，各因子對提取率的影響依次為料液比>提取時間>粉碎度，由正交試驗得出最佳工藝條件為A2B3C3，即料液比為1∶30，粉碎度為100目，提取時間為20 min。在此條件下進(jìn)行驗證試驗，香根油的提取率為5.98%，高于任一單因素試驗，可以確定此為最佳條件。

3.5 成分分析

香根油成分經(jīng)GC-MS分析，以計算機(jī)檢索譜庫確定化合物，以質(zhì)譜離子峰面積百分?jǐn)?shù)表示各成分含量，分析結(jié)果見表3。

表3 香根油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 3 The analysis results of chemical compounds of vetiver oil

續(xù) 表

由表3可知，香根油提取物中共鑒定出匹配度75%以上的揮發(fā)性成分24種，含量占全部萃取物的35.77%，其中烷烴類物質(zhì)7種，萜烯類物質(zhì)7種，醇類物質(zhì)5種，酮類物質(zhì)2種，酯類物質(zhì)1種，酚類物質(zhì)1種，雜環(huán)類物質(zhì)1種，萜烯類化合物是香油根油的主要成分。

3.6 抑菌結(jié)果

香根油和青霉素鈉對不同細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果見表4和表5。

表4 香根油的最小抑菌濃度(MIC)Table 4 The minimum inhibitory concentration(MIC)of vetiver oil mg/mL

表5 香根油的最小殺菌濃度(MBC)Table 5 The minimum bactericidal concentration(MBC)of vetiver oil mg/mL

由表4和表5可知，香根油對6種細(xì)菌都具有一定的抑菌和殺菌能力，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，其最小抑菌濃度(MIC)為0.233 mg/mL，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力相對最差，其最小抑菌濃度分別為1.104，1.256 mg/mL；香根油對枯草芽孢桿菌的殺菌效果最好，最小殺菌濃度(MBC)為0.463 mg/mL，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果最差，最小殺菌濃度分別為2.25，2.5 mg/mL，對其他3種細(xì)菌的殺菌能力較一致。原因是精油中含有一定量的異丁香酚和甲酸龍腦酯，同時還含有大量的萜烯類化合物，具有廣泛的抑菌和抗氧化能力。

4 結(jié)論

對超聲波萃取香根油的影響因素進(jìn)行了研究，分別探討了料液比、粉碎度和時間對提取率的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，得到香根油的最佳提取工藝條件為：以無水乙醇為溶劑，料液比1∶30，粉碎度100目，提取時間20 min，香根油提取率5.98%；通過GC-MS從香根油中共鑒定出24種化合物，占總萃取物的35.77%，主要是萜烯類化合物；香根油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、地衣芽孢桿菌、高地芽孢桿菌均有一定的抑菌能力，可以對其抗菌機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果可以為開發(fā)一種新的天然抑菌劑，進(jìn)而為香根草的綜合利用提供理論支持。