紫蘇粕和豆粕共發酵生產紫蘇醬的發酵條件研究

張昕，王彩蓉，呂源嘉，管玲玲

(吉林工商學院糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，長春 130507)

紫蘇(PerillafrutescensL.)在中國的栽培歷史悠久，分布廣泛，屬唇形科，古名荏，又名青蘇、野蘇、桂芢、皺葉蘇、蘇麻等[1]，是傳統的藥食同源植物[2]。紫蘇籽冷榨紫蘇油后剩余的紫蘇粕中[3]，含有高達40%左右的蛋白質，紫蘇蛋白中含有18種氨基酸，包括人體所必需的全部8種氨基酸，是一種較優良的植物蛋白資源[4]。紫蘇粕中還有剩余的紫蘇油脂、多糖、纖維素和抗氧化物質等[5-7]。目前國內外重點研究和開發紫蘇油產品[8-12]，剩余大量的紫蘇粕尚未有效利用，造成資源的巨大浪費[13]。本文研究以紫蘇粕和豆粕為原料共同發酵生產紫蘇醬的發酵條件，研究成曲添加量、鹽水濃度、納豆芽孢桿菌接菌量、發酵溫度、發酵時間、攪拌醬醅速度、攪拌醬醅時間對紫蘇醬品質的影響[14]，確定最優的發酵工藝條件[15]，為紫蘇粕資源的利用和風味紫蘇醬的生產提供了基本研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇粕、豆粕：吉林省洮南市；食鹽：吉林省長春鹽業有限公司；高大毛霉M5.17(Mucormucedo)：吉林工商學院微生物實驗室從自然發酵的紫蘇粕中分離；納豆芽孢桿菌AS 1.107(Bacillusnatto)：吉林工商學院微生物實驗室購買菌種；化學試劑：國藥集團化學試劑有限公司，分析純；水：自制純凈水。

1.2 儀器與設備

SQW-60D三清超微粉碎機 山東三清不繡鋼設備有限公司；BS 11OS型電子天平 西安賽多利斯儀器系統有限公司；GR80TR型ZEALWAY自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司；GXZ-300光照培養箱 寧波樂電儀器制造有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇大地自動化儀器廠；Toppette移液槍 大龍醫療設備(上海)有限公司；C-MAG HS10磁力加熱攪拌器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇醬發酵工藝流程

1.3.2 操作要點

菌種馴化培養：取紫蘇粕40 g，大豆粕60 g，面粉20 g，添加紅棗粉1 g作為生長因子，按100 g干曲料加水量100 mL浸泡8 h，pH值自然，溫度121 ℃的條件下進行滅菌處理25 min；制成紫蘇粕制曲培養基三角瓶；將高大毛霉M5.17斜面菌種按紫蘇粕制曲培養基質量的5%轉接到三角瓶中，在溫度(29±1) ℃條件下培養120 h，制成紫蘇粕制曲培養基的三角瓶菌種[16]。

原料處理：精選出紫蘇粕和豆粕，通過超微粉碎機將紫蘇粕粉碎成粒徑80 μm的顆粒。按紫蘇粕和豆粕質量比為2∶3的比例，100 g干料加水100 mL混勻浸泡8 h[17]。

滅菌：在高壓滅菌鍋中于121 ℃條件下滅菌25 min。

面粉：在滅菌后的紫蘇粕和豆粕的表面鋪上面粉保溫，質量比為紫蘇粕∶豆粕∶面粉為2∶3∶1[18]。

接菌：將滅菌后的原料混勻，溫度29 ℃時，按接種量0.35%接種高大毛霉M5.17三角瓶菌種[19]。

制曲：在(29±1) ℃培養48 h制曲。

成曲：當培養室中的曲料長出大量菌絲，曲料呈灰白色，即為成曲[20]。

粉碎：取出成曲，用粉碎機粉碎。

加成曲：將粉碎后的成曲放入陶罐。

加食鹽水：配制鹽水，將鹽水煮沸后再冷卻，按照醬曲與鹽水的比例添加鹽水[21]。

前發酵：醬醅保溫發酵溫度39～45 ℃[22]。

攪拌醬醅：在醬醅靜止發酵5天以后，每隔12 h攪拌醬醅1次[23]。

補水：在發酵過程中間隔5天，每1000 mL醬醅中補加純凈水10 mL。

接種納豆芽孢桿菌：取納豆芽孢桿菌純種干粉1 g加入無菌生理鹽水100 mL，于41 ℃恒溫震蕩培養5 h，在醬醅保溫發酵結束前5天接入納豆芽孢桿菌液體菌種。

后發酵：于41 ℃繼續保溫后酵5天即為成品。

1.3.3 氨基酸態氮的測定

檢測指標按GB 2718-2003《醬衛生標準》的要求執行。醬醅中氨基酸態氮的含量反映了紫蘇醬發酵過程中蛋白質的水解程度，是發酵醬的一項主要指標，氨基酸態氮的測定采用GB/T 5009.39-2003規定的測定氨基酸態氮含量的甲醛值法。

2 結果與分析

2.1 成曲添加量對紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響實驗結果

準備陶罐，分別加入成曲200，220，240，260，280，300，320 g，每罐加入15 °Bé鹽水1000 mL，在納豆芽孢桿菌接菌量0.5%、攪拌醬醅速度60 r/min、攪拌醬醅時間25 min的條件下，在41 ℃的恒溫培養室中發酵紫蘇醬醅30天。測定醬醅氨基酸態氮的含量，結果見圖1。

圖1 成曲添加量對氨基酸態氮含量的影響實驗結果Fig.1 The experimental results of the effect of the additive amount of finished koji on amino acid nitrogen content

由圖1可知，每1000 mL鹽水中成曲添加量200～260 g，隨著成曲添加量的增加，氨基酸態氮含量逐漸增加，在成曲添加量為260 g時，氨基酸態氮含量達到最高；在成曲添加量為260～300 g時，隨著成曲添加量的增加，氨基酸態氮含量逐漸下降。分析原因：成曲添加量少，醬醅中營養物質含量較低，導致氨基酸含量較低；成曲添加量過高，紫蘇醬醅中營養物質含量高，水分含量低，降低了分子的擴散性，蛋白質水解不充分。通過優化得到醬醅中氨基酸態氮含量較高的3個水平，即每1000 mL鹽水中成曲添加量分別為260，280，300 g。

2.2 鹽水濃度對紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響實驗結果

分別配制濃度為11，12，13，14，15，16，17 °Bé的鹽水，每罐中加入成曲質量為260 g，分別添加不同濃度的鹽水1000 mL，其他同2.1。測定醬醅氨基酸態氮的含量，結果見圖2。

圖2 鹽水濃度對氨基酸態氮含量的影響實驗結果Fig.2 The experimental results of the effect of the brine concentration on amino acid nitrogen content

由圖2可知，在鹽水濃度為11～14 °Bé時，氨基酸態氮含量隨著鹽水濃度的增加而緩慢增加；在鹽水濃度為14 °Bé時，氨基酸態氮含量達到最高；在鹽水濃度為14～17 °Bé時，氨基酸態氮含量隨著鹽水濃度的增加而顯著減少。分析原因可能是鹽水濃度較低，不能充分抑制細菌、酵母菌等雜菌生長，導致醬醅中的氨基酸被雜菌利用或降解；但高濃度的鹽水又抑制了紫蘇醬醅中酶的活力。通過優化得到醬醅中氨基酸態氮含量較高的3個水平，即鹽水濃度為13，14，15 °Bé。

2.3 納豆芽孢桿菌接菌量對紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響實驗結果

分別取14 °Bé鹽水1000 mL，納豆芽孢桿菌液體菌種接菌量與鹽水體積比為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，其他同2.2。測定醬醅氨基酸態氮的含量，結果見圖3。

圖3 納豆芽孢桿菌接菌量對氨基酸態氮含量的影響實驗結果Fig.3 The experimental results of the effect of the inoculation amount of Bacillus natto on amino acid nitrogen content

由圖3可知，在納豆芽孢桿菌接菌量為0.1%～0.4%時，氨基酸態氮含量隨著納豆芽孢桿菌接菌量的增加而增加。當納豆芽孢桿菌接菌量為0.4%時，氨基酸態氮含量達到最高，之后隨著納豆芽孢桿菌接菌量的增加，氨基酸態氮的含量又逐漸減少。分析原因可能是納豆芽孢桿菌接菌量過高，納豆芽孢桿菌利用醬醅中氨基酸作為氮源物質合成菌體蛋白。通過優化得到醬醅中氨基酸態氮含量較高的3個水平，即納豆芽孢桿菌接菌量分別為0.3%、0.4%和0.5%。

2.4 發酵溫度對紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響實驗結果

分別取成曲質量260 g，添加14 °Bé鹽水1000 mL，納豆芽孢桿菌接菌量與鹽水體積比為0.4%。在攪拌醬醅速度60 r/min、攪拌醬醅時間25 min的條件下，分別放到溫度為39，40，41，42，43，44，45 ℃的恒溫培養室中發酵紫蘇醬醅30天。測定醬醅氨基酸態氮的含量，結果見圖4。

圖4 發酵溫度對氨基酸態氮含量的影響實驗結果Fig.4 The experimental results of the effect of the fermentation temperature on amino acid nitrogen content

由圖4可知，當發酵溫度為39～43 ℃時，氨基酸態氮含量隨著溫度的升高而升高；當發酵溫度為43 ℃時，氨基酸態氮含量達到最高；當發酵溫度為43～45 ℃時，氨基酸態氮含量隨著發酵溫度的升高而下降。分析原因：溫度是影響酶活力及酶促反應速度的主要因素，發酵溫度43 ℃是毛霉蛋白酶催化蛋白質水解為氨基酸的最適溫度，所產生的氨基酸態氮含量最高。通過優化得到醬醅中氨基酸態氮含量較高的3個水平，即發酵溫度42，43，44 ℃。

2.5 發酵時間對紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響實驗結果

將恒溫培養室溫度設定為43 ℃，其他同2.4，分別培養5，10，15，20，25，30，35天。測定醬醅氨基酸態氮的含量，結果見圖5。

由圖5可知，在發酵時間為5～25天時，氨基酸態氮含量隨著發酵時間的增加而增加。當發酵時間為25天時，氨基酸態氮含量達到最高。發酵時間為25～35天時，氨基酸態氮含量隨著發酵時間的增加而減少。分析原因：發酵時間短，紫蘇醬醅中的蛋白質未完全水解成氨基酸；發酵時間過長，紫蘇醬醅中的各種酶催化氨基酸的降解以及與其他物質發生化學反應；當發酵時間為25天時，紫蘇醬發酵基本完成。通過優化得到醬醅中氨基酸態氮含量較高的3個水平，即發酵時間為20，25，30天。

圖5 發酵時間對氨基酸態氮含量的影響實驗結果Fig.5 The experimental results of the effect of the fermentation time on amino acid nitrogen content

2.6 攪拌醬醅速度對紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響實驗結果

設定攪拌醬醅的速度分別為20，30，40，50，60，70，80 r/min，發酵時間25天，其他同2.5。測定醬醅氨基酸態氮的含量，結果見圖6。

圖6 攪拌醬醅速度對氨基酸態氮含量的影響實驗結果Fig.6 The experimental results of the effect of the stirring speed of bean sauce mash on amino acid nitrogen content

由圖6可知，在攪拌醬醅速度為20～50 r/min時，氨基酸態氮含量隨著攪拌醬醅速度的增加而增加。當攪拌醬醅速度為50 r/min時，氨基酸態氮含量達到最高。當攪拌醬醅速度為50～80 r/min時，氨基酸態氮含量隨著攪拌醬醅速度的增加而減少。分析原因可能是攪拌醬醅速度慢，醅料不能與酶充分混合和接觸，不能均勻發酵，醬醅中O2含量低影響了微生物的呼吸作用和氧化還原反應，攪拌醬醅速度過快使醬醅中氣泡過多，影響醅料與酶充分混合和接觸。通過優化得到醬醅中氨基酸態氮含量較高的3個水平，即攪拌醬醅速度為40，50，60 r/min。

2.7 攪拌醬醅時間對紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響實驗結果

設定攪拌醬醅速度為50 r/min，每12 h攪拌醬醅時間分別為5，10，15，20，25，30，35 min，其他同2.6。測定醬醅氨基酸態氮的含量，結果見圖7。

圖7 攪拌醬醅時間對氨基酸態氮含量的影響實驗結果Fig.7 The experimental results of the effect of the stirring time of bean sauce mash on amino acid nitrogen content

由圖7可知，在攪拌醬醅時間為5～30 min時，氨基酸態氮含量隨著攪拌醬醅時間的增加而增加。當攪拌醬醅時間為30 min時，氨基酸態氮含量達到最高。在攪拌醬醅時間為30～35 min時，氨基酸態氮含量隨著攪拌醬醅時間的增加而減少。分析原因可能是攪拌醬醅時間短，醅料不能與酶充分混合和接觸，不能均勻發酵，醬醅中O2含量低影響了微生物的呼吸作用和氧化還原反應，攪拌醬醅時間過長使醬醅中氣泡過多，影響醅料與酶充分混合和接觸。通過優化得到醬醅中氨基酸態氮含量較高的3個水平，即攪拌醬醅時間為25，30，35 min。

2.8 紫蘇醬發酵條件L18(37)正交試驗結果

以氨基酸態氮含量為評價指標，選擇成曲添加量、鹽水濃度、納豆芽孢桿菌接菌量、發酵溫度、發酵時間、攪拌醬醅速度、攪拌醬醅時間7個影響因素，從單因素試驗中選出氨基酸態氮含量較高的3個水平，采用L18(37)正交試驗設計，優化紫蘇醬醅的發酵條件，結果見表1。

表1 紫蘇醬醅發酵條件正交試驗結果Table 1 The orthogonal test results of perilla sauce's fermentation conditions

續 表

由表1可知，各因素對發酵紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量的影響大小為：A>D>E>F>C>G>B，即成曲添加量>發酵溫度>發酵時間>攪拌醬醅速度>納豆芽孢桿菌接菌量>攪拌醬醅時間>鹽水濃度。最優方案為A2B1C1D2E2F2G3，即紫蘇醬發酵的最優方案為：1000 mL鹽水中成曲添加量280 g、鹽水濃度13 °Bé、納豆芽孢桿菌接菌量0.3%、發酵溫度43 ℃、發酵時間25天、攪拌醬醅速度50 r/min、攪拌醬醅時間35 min。在最優條件下進行驗證試驗，發酵紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量為0.69 g/dL。

3 結論

本研究通過單因素試驗和L18(37)正交試驗對紫蘇醬發酵條件進行優化，得到生產紫蘇醬的最優發酵條件為：1000 mL鹽水中成曲添加量280 g、鹽水濃度13 °Bé、納豆芽孢桿菌接菌量0.3%、發酵溫度43 ℃、發酵時間25天、攪拌醬醅速度50 r/min、攪拌醬醅時間35 min。在最優發酵條件下進行驗證試驗，發酵紫蘇醬醅中氨基酸態氮含量為0.69 g/dL，大于0.40 g/dL，符合國家標準。

紫蘇醬的感官指標與傳統醬相比，狀態微稠，顏色微深，具有紫蘇特有的香味和豆醬特有的鮮味，咸度適中，口感純正，符合國家標準。

以紫蘇粕為原料發酵生產紫蘇醬，既利用了紫蘇粕中的大量蛋白質、多糖和剩余的紫蘇油脂，同時紫蘇粕特殊的營養成分、保健成分和風味物質也保留在醬中，實現了紫蘇粕的全營養利用，兼有傳統豆醬的營養成分與風味，集調味、增香和保健為一體，本研究為利用紫蘇粕生產特殊風味的紫蘇醬產品提供了基本研究數據。

本試驗運用正交試驗方法進行紫蘇粕和豆粕共發酵生產紫蘇醬的發酵條件優化，和神經網絡方法相比具有一定的局限性。下一步擬采用神經網絡法進行優化。