延邊泡菜益生性乳酸菌的篩選 及其部分生物學特性分析

舒慧萍，張冬星，張海月，單曉楓*，錢愛東*

(1.吉林農業大學 動物科學技術學院，動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室， 長春 130118；2.敦化市畜牧業管理局，吉林 敦化 133700)

目前，常用食品益生菌中以乳酸菌最為常見，乳酸菌在自身代謝生長過程中分泌的有機酸和細菌素能夠抑制食品中病原菌的生長繁殖[1]，防止食品腐敗，延長保質期[2]，因而可將乳酸菌應用于新型天然食品防腐劑的研發，以代替化學防腐劑。同時，乳酸菌在發酵過程中能夠降低pH值，進而改善蔬菜制品的風味，可作為風味和口感增強劑[3，4]，從而減少香精、香料的使用，使產品更趨于天然、綠色[5]。

而發酵泡菜作為一種由乳酸發酵的蔬菜制品，具有悠久的歷史，并已被世界公認為一種健康的發酵食品。參與發酵的乳酸菌在發酵過程中起主導作用，對人體具有改善腸道不適，增強結腸功能與穩定性，降低血液膽固醇以及抗癌等保健作用[6]，且能夠提高蔬菜制品的營養價值，基于乳酸菌的上述生物學特性，使其在食品行業中被廣泛應用。因而本實驗旨在從發酵泡菜中分離獲得具有抑菌特性及抗逆性的乳酸菌優勢菌株，為日后實際應用該乳酸菌提供了理論基礎，以期運用到食品中提高食品品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)CVCC233、CVCC236、CVCCK88；沙門氏菌(Salmonella)CVCC3383、CVCC3780、CVCC3775、CVCC503、CVCC79102；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CVCC-519：以上均由本實驗室保存。

乳酸菌瓊脂培養基(MRS瓊脂)、Luria-Bertani瓊脂培養基(LB瓊脂)：均購自青島高科園海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒、生理生化管：購自北京索萊寶科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒及PCR擴增試劑盒等：均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集與保存

樣品為購自延邊朝鮮族的自家發酵泡菜，低溫運至實驗室，于-80 ℃下甘油保存。

1.2.2 乳酸菌的分離純化

稱取1 g發酵泡菜與10 mL的PBS充分混合均勻，對混合液進行連續十倍倍比稀釋，將不同梯度稀釋液涂布至MRS固體培養基表面，37 ℃下厭氧靜置培養72 h[7]，觀察不同細菌形態，挑取邊緣整齊，顏色為乳白色的圓形實心單菌落于MRS肉湯中，37 ℃厭氧靜置培養48 h，在MRS固體平板上對其進行劃線純化。

1.2.3 生理生化實驗

首先將純化的菌株進行革蘭氏染色及過氧化氫酶實驗，選取革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性菌進行硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、吲哚(靛基質)實驗、硫化氫實驗和糖發酵實驗，實驗結果對照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[8]、《乳酸細菌的分類鑒定與實驗方法》及《常見細菌系統鑒定手冊》進行菌種的綜合判定。

1.2.4 乳酸菌分子鑒定

提取分離株DNA，采用16S rDNA通用引物進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)，PCR反應體系參照文獻[9]，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rDNA 擴增片段。由吉林長春庫美有限公司對PCR 產物進行測序。將所得16S rDNA序列結果與GenBank數據庫中已知的相關序列進行相似性分析，并通過Blast 程序多重比對，采用Mega 6.0 軟件構建系統進化樹[10]。

1.2.5 抑菌實驗1.2.5.1 牛津杯法

本實驗采用牛津杯法。在董雨馨等人的操作方法上進行改進，具體操作方法如下：將已活化的指示菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)CVCC233、CVCC236、CVCCK88；沙門氏菌(Salmonella)CVCC3383、CVCC3780、CVCC3775、CVCC503、CVCC79102和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CVCC-519的濃度調整至106cfu/mL，涂布于LB平板，采用牛津杯法進行打孔，向牛津杯中加入分離株培養上清，于37 ℃下培養12 h，以加入等量MRS液體作為對照，量取并記錄抑菌圈直徑[11]。

抑菌活性判定標準為：12.00 mm≥抑菌圈直徑>8.00 mm表示弱抑菌性，16 mm≥抑菌圈直徑>12 mm表示中度抑菌性，20 mm>抑菌圈直徑>16 mm表示較強抑菌性，抑菌圈直徑 ≥20 mm表示強抑菌性[12]。

1.2.5.2 共培養法

通過共培養法，進一步研究乳酸菌的胞外上清液對病原菌的抑制作用。將已活化的濃度為106cfu/mL的指示菌按1%接種至LB液體培養基中，同時按5%接入分離株濾過上清液，于37 ℃震蕩培養12 h，以接入等量PBS緩沖溶液作為對照，采用平板計數法記錄指示菌的活菌數量，并計算指示菌的存活率。存活率按下式計算：

存活率=log(實驗組菌液濃度)/log(對照組菌液濃度)×100%。

1.2.6 抗逆性實驗

本實驗研究了分離株對酸、膽鹽的耐受性，在Mattika等人的操作方法上進行改進，具體操作方法如下：將活化好的分離株菌液濃度調整至106cfu/mL，按10%接入pH 2.0的 MRS肉湯中，以接入等量pH 6.8的PBS作為對照，37 ℃下厭氧靜置培養2 h；另按10%接入含0.3%膽鹽的MRS-bile肉湯培養基中，以接入等量PBS作為對照，37 ℃下厭氧靜置培養4 h，采用平板計數法分別記錄活菌數量，并計算存活率[13]，存活率按下式計算：

存活率=log(實驗組菌液濃度)/log(對照組菌液濃度)×100%。

2 結果與分析

2.1 菌落及菌體形態觀察

實驗獲得3株生長迅速的疑似乳酸菌菌株，分別命名為L1、L2和L3，其菌落形態見圖1，可見形態為邊緣整齊、中央有突起或扁平的乳白色圓形菌落，大小不一。

圖1 分離株菌落形態觀察Fig.1 Observation on colony morphology of isolated strains

注: A為菌株L1;B為菌株L2;C為菌株L3。

分離株革蘭氏染色結果見圖2。分離株為G+菌，呈短桿狀，單個或呈短鏈狀排列。

圖2 分離株革蘭染色結果Fig.2 Gram staining results of isolated strains

注：A為菌株L1;B為菌株L2;C為菌株L3。

2.2 理化實驗結果

生理生化鑒定結果顯示：過氧化氫實驗中3株分離株均無氣泡產生，表明呈過氧化氫陰性；滴加硝酸鹽還原試劑甲、乙液后，不變色；加入微量鋅粉后，L1、L2、L3均呈紅色，表明硝酸還原陰性；明膠液化實驗結果：4 ℃呈固態，即明膠液化陰性；滴加靛基質試劑后反應呈黃色，表明吲哚陰性；與硫化氫反應后呈無色，表明硫化氫陰性；綜上，L1、L2、L3均不能發生過氧化氫實驗、硝酸還原實驗、明膠液化實驗，均不能產生吲哚及硫化氫，由此可初步判定3株菌為乳酸桿菌屬。進一步進行糖發酵實驗，結果見表1。

表1 分離株生理生化測定結果Table 1 Physiological and biochemical determination results of isolated strains

注：“+”表示菌株反應呈陽性；“-”表示菌株反應呈陰性。

2.3 乳酸菌分子鑒定

圖3 分離株16S rDNA序列擴增檢測Fig.3 Detection of 16S rDNA sequence of isolated strains by amplification

注：M為DL-2000 Markers;1～3為分離株L1、L2、L3 的PCR擴增產物。

圖4 分離株系統發育進化樹Fig.4 The phylogenetic trees of isolated strains

分離株16S rDNA 基因PCR擴增結果見圖3。可見在1500 bp左右出現條帶。對分離株L1、L2、L3的16S rDNA基因進行序列測定及采用Mega 6.0軟件構建系統發育樹，均分別與Lactobacillusfermentum，Lactobacilluscasei，Lactobacillusplantarum位于同一發育分支，且與上述模式菌株同源性為96%、99%、89%(見圖4)。經理化及分子生物學鑒定結果綜合判定，分離株L1、L2、L3分別為發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌。

2.4 抑菌實驗

2.4.1 牛津杯法抑菌實驗

分離株培養上清液對指示菌的抑制作用見表2。經測定，L1、L2、L3培養上清液均能對指示菌表現出不同程度的抑制作用，其中L2、L3對9株指示菌表現出了強抑制性，抑菌圈直徑最大分別達到25，23 mm；而L1與L2、L3相比，對指示菌的抑制作用相對較弱，最大抑菌圈達16 mm。

表2 分離株對指示菌的抑制效果Table 2 The inhibition effect of isolated strains on indicator bacteria

注：L1′、L2′、L3′為乳酸菌過濾培養上清液。抑菌圈直徑包含牛津杯外徑(7.80 mm)；“+”為抑菌圈直徑8.00～12.00 mm；“++”為抑菌圈直徑12.00～16.00 mm；“+++”為抑菌圈直徑16.00～20.00 mm；“++++”為抑菌圈直徑20.00～24.00 mm。

2.4.2 共培養實驗

分離株培養上清液分別與指示菌菌液進行共培養，實驗結果見圖5。

圖5 分離株與指示菌共培養實驗結果Fig.5 The results of co-culture test for isolated strains and indicator bacteria

注：A為 L1上清液與指示菌共培養;B為L2上清液與指示菌共培養;C為L3上清液與指示菌共培養。

大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌與L2、L3培養上清液共培養后，其存活率可分別降至66.31%、56.2%、72.07%與65.69%、56.18%、72.75%，可見L2、L3培養上清液對指示菌有較強的抑制作用，而指示菌菌液與L1培養上清液共培養后存活率分別為85.98%、97.41%、88.73%，可見L1培養上清液對指示菌的抑制作用相對L2、L3較弱，與打孔法抑菌實驗結果一致。

2.5 抗逆性實驗

分離株L1、L2、L3抗逆性實驗結果見圖6。

圖6 分離株抗逆性實驗結果Fig.6 The results of stress tolerance test of isolated strains

注：A為分離株對pH 2的耐受性；B為分離株對0.3%膽鹽的耐受性。

分離株L1、L2、L3在pH 2的環境中培養2 h后，存活率分別為82.58%、48.34%、48.49%，可見L1相較L2、L3差異極顯著，耐酸性能力更高；在含0.3%膽鹽的培養基中培養4 h后，存活率分別為66.56%、54.8%、70.62%，可見L1、L2、L3均具有較強的耐膽鹽能力，其中L3的耐膽鹽能力最強，且與L1、L2相比差異極顯著。

3 結論

乳酸菌作為發酵劑被廣泛應用于泡菜、酸奶、發酵肉制品及功能性食品等食品工業中，因而本實驗從可食用泡菜中分離乳酸菌菌株，具有一定的食品安全性。杜曉華等從四川發酵泡菜中獲得1株植物乳桿菌；周光燕等從發酵泡菜汁樣品中分離得到8株植物乳桿菌、4株干酪乳桿菌和2株雙發酵乳桿菌；而本實驗篩選所得的分離株為植物乳桿菌、發酵乳桿菌和干酪乳桿菌，可見參與泡菜發酵的乳酸菌以植物乳桿菌為主[14,15]。

陳靜等從泡菜中分離得到4株乳酸桿菌，采用打孔法研究了分離株發酵液對金黃色葡萄球菌等指示菌的抑菌能力，研究發現：分離株J-4發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制效果顯著，抑菌圈直徑可達17 mm，而本實驗中抑制實驗結果表明：干酪乳桿菌L2與植物乳桿菌L3的培養上清液對指示菌的抑菌圈直徑均可達到20 mm，而發酵乳桿菌L1的培養上清液對指示菌的抑菌圈直徑可達16 mm，可見本實驗分離所得的乳酸菌抑菌效果更強；同時，共培養實驗結果表明指示菌經與分離株上清液共培養后存活率均有所降低，且L1對指示菌存活的抑制作用小于L2與L3，該實驗結果與牛津杯法抑菌結果一致，充分驗證了乳酸菌的胞外產物中含有抑菌物質，能夠有效抑制致病菌的生長，為日后研發新型天然食品防腐劑奠定了理論基礎[16]。

通常人體進食后胃部 pH 在3.0～5.0之間，小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%范圍內波動[17],因此益生性乳酸菌應對酸和膽鹽具有一定的耐受性，這是更好地發揮益生作用的關鍵。Kim 等對6株從泡菜中分離出的乳酸菌進行了耐酸實驗，研究發現其在pH 2.5的環境中存活率均在62%以上，而本實驗檢測的分離株抗逆性實驗結果表明，發酵乳桿菌L1、干酪乳桿菌L2與植物乳桿菌L3分別在pH 2的環境中作用2 h后，存活率分別可達82.58%、48.34%和48.49%，可見不同菌株對pH 2酸性環境的耐受性有所差異[18]；同時吳云等在膽鹽耐受性實驗中研究發現，膽鹽濃度為0.2%和0.3%時乳酸菌活菌數都達到了107cfu/mL 以上，存活率為88.48%，這說明篩選出的植物乳桿菌W對膽鹽有較強的耐受能力，而本實驗檢測了分離株在含0.3%膽鹽培養基中分別培養4 h后的活菌數，經計算存活率分別達70.62%、66.56%和54.8%[19]。因此，篩選出的3株分離株均有一定的抗逆性，具有潛在的生產應用價值，為后續評估其他益生潛力奠定了基礎。