響應面法優化提取香菜根中總黃酮的工藝研究

張珍，楊秦,2，肖洪,3,4，史晶晶，金玉成，劉士健*

(1.西南大學 食品科學學院，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶 400715； 2.西南大學 柑桔研究所，重慶 400712；3.北京正博和源科技有限公司，北京 102400； 4.北京正博和源科技有限公司重慶分公司，重慶 400716)

香菜的別稱是芫荽，是傘形科植物的一種，作為一種芳香蔬菜，香菜是歷史上最早被食用的，因為它具有特殊的香味，也常常被用作調味料，香菜最早被發現是在地中海沿岸及中亞地區，西漢時期被傳入中國，同時對中國古代的飲食產生了很大的影響[1-4]。香菜的莖葉中具有豐富的營養素，如蛋白質、脂肪、礦物質、纖維素、鉀、鈣、鈉、鐵、維生素等。對香菜根部進行檢測，發現其根部也具有多種化學成分，這些化學成分有糠醛、不飽和脂肪酸酯、萜類、黃酮等[5]，同時香菜根可以作為提取天然糠醛的原料[6]。

總黃酮按結構可分為黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、二氫黃酮類等[7]。眾多實驗結果表明總黃酮具有很強的抗氧化性、抗病毒能力[8]，能夠抑制炎癥、多種疾病甚至癌癥[9]，有的黃酮還具有抗心血管疾病的作用[10]。黃酮的提取方法有熱水提取法、超聲提取法、堿液提取法、超濾法、微波提取法等[11]，其中超聲提取法和微波提取法有提取時間短、提取量多、提取條件溫和對總黃酮的活性影響較小等優點[12,13]。黃酮含量的測定方法有分光光度法、高效液相色譜法、薄層掃描法、毛細管電泳法等[14]，毛細管電泳法前期處理樣品簡單，溶劑消耗少，結果準確，是值得推薦的測量方法[15]。人們習慣使用香菜莖葉，往往會將香菜根丟棄，香菜的根部含有一定量的黃酮，然而對香菜根中的提取工藝黃酮研究較少，因此本研究探索了響應面法優化提取香菜根中總黃酮的工藝，為香菜的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菜根 山東省泰安市；蘆丁(Rutin)標準品 安徽合肥博美；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑(均為分析純)；722型可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；1580多功能離心機 基因有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的測定

精確稱取0.0191 g干燥的蘆丁標準品放于燒杯中，用70%的乙醇溶解，用玻璃棒引流至100 mL的容量瓶中，玻璃棒和燒杯需用70%的乙醇多次潤洗，用70%乙醇定容，搖勻，得質量濃度為0.0191 g/mL的標準溶液。先用移液管分別吸取1，2，3，4，5，6 mL標準品溶液，置于6個25 mL容量瓶中，空白容量瓶中用移液管移取6 mL 70%乙醇溶液，再加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，6 min后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，用體積分數70%的乙醇定容至25 mL，充分搖勻，靜止15 min后，于510 nm波長處測定吸光度,并繪制標準曲線[16]。標準曲線方程為y=0.4572x+0.0017；相關系數R2=0.9998。標準曲線圖見圖1。

1.2.2 總黃酮含量的計算

由標準曲線得到樣品溶液的濃度，再根據濃度計算總黃酮的含量：

總黃酮提取量(mg/g)=C×V×n/W。

式中：C為標準曲線上獲得的濃度，g/mL；V為黃酮提取液的體積，mL；n為稀釋倍數；W為香菜根粉末的重量，g。

圖1 蘆丁溶液標準曲線圖Fig.1 Standard curve of rutin solution

1.2.3 單因素試驗

將購買的香菜根洗凈，切成小段，放置于電熱恒溫干燥箱內，70 ℃干燥6 h至恒重。干燥好的香菜根用粉碎機打磨成粉，過40目篩，將過篩后的粉末裝于自封袋中，并保存在干燥器內待用。

準確稱取香菜根粉末1.0 g，置于具塞三角瓶中，分別以提取時間、提取溫度、液料比、乙醇體積分數為單因素，研究不同單因素對香菜根總黃酮提取量的影響[17]。

1.2.3.1 確定最佳提取時間

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分數70%、液料比20∶1(mL/g)、提取溫度70 ℃的條件不變，設置提取時間為3，3.5，4，4.5，5 h進行提取。

1.2.3.2 確定最佳提取溫度

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分數70%、液料比20∶1(mL/g)、提取時間4.5 h的條件不變，設置提取溫度為60，65，70，75，80 ℃進行提取。

1.2.3.3 確定最佳液料比

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分數70%、提取時間4.5 h、提取溫度70 ℃的條件不變，設置液料比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL/g)進行提取。

1.2.3.4 確定最佳乙醇體積分數

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定提取時間4.5 h、提取溫度70 ℃，液料比30∶1(mL/g)的條件不變，設置乙醇體積分數為60%、65%、70%、75%、80%進行提取。

1.2.4 響應面試驗設計

用Design-Expert V8.0.6 軟件處理數據，依據單因素試驗結果，利用Box-Behnken 中心組合試驗設計原理[18]，選取液料比(A)、乙醇體積分數(B)、提取溫度(C)為試驗因素，將總黃酮提取量作為響應值，設計試驗，響應面因素水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對香菜根總黃酮提取量的影響

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分數70%、液料比20∶1(mL/g)、提取溫度70 ℃的條件不變，設置提取時間3，3.5，4，4.5，5 h進行提取，試驗結果見圖2。

由圖2可知，在3～4.5 h之間，香菜根總黃酮的提取量與時間呈正相關；當提取時間達到4.5 h，后總黃酮的提取量呈下降趨勢，這可能是總黃酮隨著時間的增加已經基本被提取出來，4.5 h后隨著時間的增加被提取出的總黃酮會被分解一小部分，從而導致曲線呈下降趨勢。

圖2 提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.2 The effect of extraction time on extraction amount of total flavonoids

2.1.2 提取溫度對香菜根總黃酮提取量的影響

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分數70%、液料比20∶1(mL/g)、提取時間4.5 h的條件不變，設置提取溫度為60，65，70，75，80 ℃進行提取，試驗結果見圖3。

圖3 提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

由圖3可知，香菜根總黃酮的提取量在70 ℃時達到最大。當溫度低于70 ℃時，有可能由于乙醇分子與香菜根顆粒接觸不夠充分，導致總黃酮的提取量較少；當溫度大于70 ℃時，因為溫度的提高而導致乙醇揮發，使得實際的乙醇體積分數低于70%，也有可能是因為香菜根中部分黃酮物質受熱易分解，所以沒有70 ℃下提取量大，最終得出70 ℃是最優的提取溫度。

2.1.3 液料比對香菜根總黃酮提取量的影響

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分數70%、提取時間4.5 h、提取溫度70 ℃的條件不變，設置液料比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL/g)進行提取，試驗結果見圖4。

圖4 液料比對總黃酮提取量的影響Fig.4 The effect of liquid-solid ratio on extraction amount of total flavonoids

由圖4可知，從整體上看，液料比在20∶1～30∶1之間，總黃酮的提取量隨著液料比的增加而逐漸增加；當液料比在30∶1～40∶1之間，總黃酮的提取量隨著液料比的增加而減少，因此可以得到30∶1是香菜根提取總黃酮的最優液料比。

2.1.4 乙醇體積分數對香菜根總黃酮提取量的影響

準確稱取香菜根粉末1.0 g，固定提取時間4.5 h、提取溫度70 ℃，液料比30∶1(mL/g)的條件不變，設置乙醇體積分數60%、65%、70%、75%、80%進行提取，試驗結果見圖5。

圖5 乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響Fig.5 The effect of ethanol volume fraction on extraction amount of total flavonoids

由圖5可知，在乙醇體積分數為60%時，香菜根的總黃酮提取量較少。當乙醇體積分數在65%～70%之間時，乙醇體積分數與香菜根的總黃酮提取量呈正相關；當乙醇體積分數為70%時，香菜根的總黃酮提取量最大，繼續增加乙醇體積分數，香菜根的總黃酮提取量有所降低；當乙醇體積分數高達80%時，香菜根的總黃酮提取量最低，這可能是因為相似相溶的原理，極性越接近，溶解度越大，在乙醇體積分數為70%時，溶劑的極性和黃酮的極性最為接近，因此70%為最優的乙醇體積分數。

2.2 響應面優化提取工藝結果

2.2.1 響應面試驗設計和試驗結果

利用Box-Behnken 組合設計原理，采用Design-Expert V8.0.6軟件，根據單因素試驗結果選取液料比(A)、乙醇體積分數(B)、提取時間(C)作為自變量，將香菜根中所提取的總黃酮量作為響應值。試驗設計的方案和數據處理的結果見表2。

表2 響應面試驗設計和試驗結果Table 2 Design and results of response surface experiment

續 表

2.2.2 響應面分析

對試驗方案設計和試驗結果用Desgin-ExpertV8.0.6軟件進行統計分析，可得到二次回歸方程模型：

Y=+0.17+1.367×10-3A+5.468×10-3B+6.288×10-3C+5.468×10-4AB-1.093×10-3AC-1.641×10-3BC-4.703×10-3A2-0.021B2-0.022C2。

表3 回歸線性分析Table 3 The linear regression analysis

注：“*”為顯著(P<0.05)；“**”為極顯著(P<0.01)。

由表3可知：此模型顯著。通過模型的回歸方差分析可以得到，一次項A、B、C對總黃酮提取量的影響不顯著，二次項B2和C2對試驗結果影響極顯著(P<0.01)，A2對試驗結果影響不顯著，AB、AC、BC的交互效應不顯著。由F值和P值可知，液料比、乙醇體積分數和提取時間會影響香菜根中總黃酮的提取量，其影響力大小為：液料比<乙醇體積分數<提取時間。液料比、乙醇體積分數、提取時間對香菜根總黃酮提取量影響的響應曲面圖見圖6～圖8。

圖6 液料比與乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of liquid-solid ratio and volume concentration of ethanol on extraction amount of total flavonoids

圖7 液料比與提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-solid ratio and extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

圖8 乙醇體積分數與提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.8 Effect of ethanol volume fraction and extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

通過Design-Expert V8.0.6軟件，輸入試驗結果可得到圖6～圖8的響應曲面圖，非常直觀地表現了兩兩因素間的交互作用。響應曲面圖中圖形坡度越小代表相互作用越小，反之則越大。由圖6～圖8可知，兩兩因素間均有一定的交互作用，但交互作用相對較弱，其中BC的交互作用比較明顯，但并沒有達到顯著。

2.2.3 最佳工藝條件

通過響應面分析得到乙醇提取香菜根中總黃酮的最佳工藝條件：液料比為30.68∶1 (mL/g)，最佳乙醇體積分數為70.65%，最佳提取溫度為70.67 ℃，在的條件下，香菜根中理想的總黃酮提取量為0.1717 mg/g，由于實驗室的可操作性，最終將液料比設為31∶1 (mL/g)，乙醇體積分數設為71%，提取溫度設為71 ℃。在此條件下再次試驗，得到總黃酮的提取量為0.1691 mg/g，說明該模型的預測值與實際值之間有較好的重合性，可以用此方法預測香菜根中總黃酮的提取量。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，使用Design-ExpertV8.0.6軟件采用三因素三水平的響應面分析方法，對香菜根中總黃酮的提取工藝進行優化。通過試驗驗證，可得到最佳的工藝條件為液料比31∶1 (mL/g)，乙醇體積分數71%，提取溫度71 ℃，在此條件下，總黃酮的提取量約為0.1691 mg/g，該實驗方法有一定的可靠性。