頭孢曲松預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血損傷的作用研究

龐乃清

山西省大同市第二人民醫(yī)院腫瘤醫(yī)院 037006

目前，腦卒中已發(fā)展成為威脅人類健康的大敵，患病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，引起人們高度關(guān)注[1]。具體來說，腦卒中是機(jī)體受多種因素影響導(dǎo)致腦血管突然破裂或血管堵塞，引發(fā)大腦組織缺氧、缺血造成的腦血管疾病，尤其多見缺血性腦卒中[2-3]。眾所周知，該病治療關(guān)鍵為發(fā)病后時(shí)間窗內(nèi)早期溶栓治療，但考慮到時(shí)間窗有限，多數(shù)患者發(fā)病后入院就診時(shí)已錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，極易導(dǎo)致出現(xiàn)較多并發(fā)癥或造成終身殘疾，增加其身心痛苦及家庭負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重者甚至危及生命[4]。因此，臨床采取積極措施，加強(qiáng)腦卒中發(fā)病、損傷機(jī)理分析，是指導(dǎo)臨床制定有效防治方案的關(guān)鍵。相關(guān)研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)與腦缺血再灌注損傷有較大關(guān)聯(lián)，可釋放IL-1β等炎性因子，導(dǎo)致腦組織缺血加重[5]。故探尋有效措施控制炎癥反應(yīng)為保護(hù)缺血性腦損傷的關(guān)鍵。而頭孢曲松等β-內(nèi)酰胺類抗生素具有殺菌、神經(jīng)保護(hù)等功能，但臨床就其對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞(缺血損傷后促炎性因子生成主要細(xì)胞)活化影響等仍無定論。基于此，本次研究以36只成年健康雄性SD大鼠為研究對(duì)象，在頭孢曲松預(yù)處理后建立大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)，分析神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及IL-1β表達(dá)變化，以探討局灶性腦缺血損傷中頭孢曲松預(yù)處理的作用，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年8月36只成年健康雄性SD大鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心)，于12h晝夜循環(huán)光照恒溫箱內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水7d，體重225～250g，平均體重(236.85±4.11)g。隨機(jī)分為A組(模型組，n=18)、B組(假手術(shù)組，n=18)。A組隨機(jī)分為A1組(參照，n=9)、A2組(頭孢曲松預(yù)處理，n=9)。A組體重225～248g，平均體重(232.14±3.54)g；B組體重228～250g，平均體重(241.02±2.89)g。A組與B組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A1組體重227～248g，平均體重(234.98±3.60)g；A2組體重225～243g，平均體重(230.95±3.75)g。A1組與A2組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器： 試劑包括武漢博士德生物工程有限公司的IL-1β試劑盒、中國(guó)天津科密歐公司的多聚甲醛、美國(guó)abCAM公司兔抗大鼠OX-42、美國(guó)abCAM公司兔抗大鼠GFAP、美國(guó)abCAM公司兔抗大鼠IL-1β等。儀器包括日本Acoma麻醉機(jī)、西安新光廠的恒溫操作臺(tái)、日本ETHICON尼龍線、中國(guó)A36大鼠線栓、瑞典Perimed激光多普勒腦血流監(jiān)測(cè)儀、瑞士metter AE-100電子分析天秤、德國(guó)CM1900 Leica冰凍切片機(jī)、日本Olympus熒光顯微鏡、美國(guó)伯樂電泳儀等。

1.2.2 給藥方法：A1組建立大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)前5d，以200mg/kg生理鹽水腹腔注射，1次/d；A2組建立MCAO模型前5d，以200mg/kg 頭孢曲松鈉(上海新先鋒藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20023427)腹腔注射，1次/d。B組無任何處理。

1.2.3 建立MCAO模型：A組術(shù)前禁食12h，不禁水；10%水合氯醛麻醉，2～3cm切口作于頸部正中，右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈等分離。頸外動(dòng)脈近心端、頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎。取適量肝素鈉溶液，以尼龍栓線頭蘸取，插入頸總動(dòng)脈切口，深度為20mm左右，直至大腦前動(dòng)脈。靜待2h，栓線拔除實(shí)現(xiàn)再灌注。B組不插線栓，不引起梗死，其余過程同A組。以大鼠出現(xiàn)同側(cè)Horner征為模型成功。

1.2.4 IL-1β表達(dá)檢測(cè)： 麻醉后，自頸正中偏右切開，多聚甲醛灌流內(nèi)固定，斷頭取腦。脫水，石蠟包埋，切片，厚度5μm。行免疫組化SABC法染色，脫臘水化，熱修復(fù)，封閉以山羊血清；加入一抗(1∶100)、二抗；DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。取5個(gè)高倍鏡視野，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顏色為棕黃色，即為陽性。

1.3 觀察指標(biāo) (1)觀察三組術(shù)后24h神經(jīng)功能缺陷評(píng)分[6]，包括自主活動(dòng)(無活動(dòng)-0分；幾乎無法正常活動(dòng)-1分；可輕度活動(dòng)，活動(dòng)范圍在鼠籠3面以內(nèi)-2分；可自主活動(dòng)，活動(dòng)范圍超過鼠籠3面-3分)、四肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱性(左側(cè)無活動(dòng)-0分；左側(cè)存在輕度活動(dòng)-1分；左側(cè)有活動(dòng)，且較為緩慢-2分；雙側(cè)活動(dòng)對(duì)稱-3分)、前肢對(duì)稱性(左側(cè)前肢無法伸展-0分；左側(cè)前肢可輕度伸展-1分；左側(cè)前肢可伸展，但不如右側(cè)-2分；雙側(cè)伸展對(duì)稱-3分)、攀援能力(無法攀援-1分；左側(cè)稍微弱-2分；可正常攀援-3分)、觸須反應(yīng)(左側(cè)無反應(yīng)-1分；左側(cè)觸須反應(yīng)減弱-2分；雙側(cè)觸須反應(yīng)對(duì)稱-3分)、雙側(cè)軀干反應(yīng)(左側(cè)無反應(yīng)-1分；左側(cè)軀干反應(yīng)減弱-2分；雙側(cè)軀干反應(yīng)對(duì)稱-3分)6項(xiàng)，總分最高18分。得分越高則神經(jīng)行為學(xué)狀況越佳。(2)觀察三組缺血半暗帶皮層、紋狀體IL-1β表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分對(duì)比 A1組、A2組、B組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分分別為(8.30±0.28)分、(12.19±0.35)分、(17.65±0.18)分。其中，A1組、A2組評(píng)分低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但A2組高于A1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 缺血半暗帶皮層、紋狀體IL-1β表達(dá)比較 A1組、A2組缺血半暗帶皮層IL-1β水平均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但A2組低于A1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。A1組、A2組紋狀體IL-1β水平均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1三組IL-1β表達(dá)對(duì)比

注：*與A2組、B組相比，P<0.01；#與B組相比，P<0.01；&與B組相比，P<0.01。

3 討論

據(jù)調(diào)查，缺血再灌注損傷后可引發(fā)大量炎性遞質(zhì)高表達(dá)，如IL-1β、IL-6等[7-8]。IL-1β為缺血損傷早期所致炎性因子。機(jī)體腦缺血再灌注損傷發(fā)生早期，可迅速激活膠質(zhì)細(xì)胞，促使大量釋放炎性因子IL-1β，直至再灌注22h，腦組織內(nèi)IL-1β水平增高，介導(dǎo)組織損傷作用[9-10]。故發(fā)病早期經(jīng)有效措施對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞激活進(jìn)行抑制，控制炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血再灌注損傷至關(guān)重要。而β-內(nèi)酰胺類抗生素具有抗菌、神經(jīng)保護(hù)作用，在中風(fēng)、腦腫瘤等神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮重要作用。目前，臨床已證實(shí)相關(guān)動(dòng)物模型中β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松神經(jīng)保護(hù)作用，考慮作用機(jī)制為促使腦內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1表達(dá)上調(diào)[11]。有研究就該問題進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)青霉素、頭孢曲松、氨芐青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素可激活谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，而非β-內(nèi)酰胺類抗生素?zé)o該作用[12]。有研究同樣在人胚胎星形膠質(zhì)細(xì)胞上驗(yàn)證該結(jié)論，調(diào)查發(fā)現(xiàn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1表達(dá)上調(diào)呈現(xiàn)劑量依賴性，最佳腹腔注射劑量為200mg/kg，在該劑量基礎(chǔ)上加重劑量并不能再促使谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1表達(dá)上調(diào)[13]。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞[14]。但是，值得注意的是，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1表達(dá)上調(diào)并非一定受功能激活影響，但頭孢菌素確實(shí)可促使生化谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)。而且，頭孢曲松預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)部分炎癥因子分泌及釋放，減輕炎性反應(yīng)，但就頭孢曲松在大鼠MCAO模型后神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制的研究仍較少。

本次研究中，A組術(shù)后24h神經(jīng)功能缺陷評(píng)分較B組降低(P<0.05)，但A2組建模前給予200mg/kg頭孢曲松腹腔注射，術(shù)后24h神經(jīng)功能缺陷評(píng)分較未注射的A1組更高。提示頭孢曲松腹腔注射可在一定程度上糾正神經(jīng)功能缺陷，與劉暢等[15]結(jié)果相符。目前，臨床已證實(shí)IL-1β的mRNA可在海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)、丘腦等部位表達(dá)，且機(jī)體出現(xiàn)大腦缺血后，可迅速激活，且持續(xù)分泌，作用時(shí)間可持續(xù)到第7天。而本次研究中，相較于B組，A組缺血半暗帶皮層、紋狀體IL-1β水平均提升，提示存在較嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，且炎性因子浸潤(rùn)腦組織介導(dǎo)損傷。此外，值得注意的是，A2組缺血半暗帶皮層IL-1β水平較A1組低(P<0.05)，提示相較于A1組，A2組炎癥反應(yīng)相對(duì)較輕。考慮與頭孢曲松預(yù)處理有關(guān)，可部分抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且能逆轉(zhuǎn)IL-1β合成及分泌，控制炎性反應(yīng)，減輕腦組織損傷，這可能是其神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制之一。而紋狀體A1組、A2組IL-1β水平差異不顯著。故推測(cè)逆轉(zhuǎn)區(qū)域在缺血半暗帶皮層，可減輕炎癥反應(yīng)，是改善神經(jīng)功能的重要機(jī)制。但目前針對(duì)頭孢曲松如何對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生作用仍無明確定論，需進(jìn)一步探討。本次研究局限之處還包括研究指標(biāo)較為單一，比如未進(jìn)一步分析對(duì)IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性指標(biāo)的影響，而大腦缺血后也可引發(fā)IL-6、TNF-α等遞質(zhì)高表達(dá)。故今后仍需加大研究力度，進(jìn)行更深層次調(diào)查分析。

綜上所述，頭孢曲松預(yù)處理在控制大鼠局灶性腦缺血損傷中具有一定作用，可抑制缺血后大鼠腦組織IL-1β表達(dá)，經(jīng)由減輕損傷后炎性反應(yīng)來保護(hù)神經(jīng)功能，需引起高度關(guān)注。