實時定量PCR法快速檢測水產品中的副溶血性弧菌

陳 琳，周青青，顧 青，*，酈 萍

(1.浙江工商大學 浙江省食品微生物技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310018； 2.杭州娃哈哈集團有限公司，浙江 杭州 310018)

副溶血性弧菌又稱腸炎弧菌，是一種廣泛分布在海洋和水產品中的嗜鹽性革蘭氏陰性菌，在腌肉、咸菜等高鹽制品中也可檢出[1]。若含有該菌的水產品未煮熟或處理不當，食用后極容易引起食物中毒[2]。因此，快速高效地檢測水產品中的副溶血性弧菌[3]，對于及時診斷和降低此類風險至關重要。

目前，食品中副溶血性弧菌的檢測方法主要可分為2類：一類是微生物平板計數方法；另一類是常規的PCR檢測[4]。平板計數方法操作復雜，耗時；常規的PCR檢測方法需要從反應體系中吸取產物做電泳，轉移過程中易污染，從而造成假陽性，而且耗費時間[5]。隨機擴增多態性分析(RAPD)是建立在PCR基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子技術，具有退火溫度低、核苷酸引物與模板的結合穩定、擴大引物配對的隨機性、檢出率高、簡單易操作、省時省力的特點[6]。實時定量PCR技術利用熒光信號實時監測PCR進程，直接進行定量分析[7]，快速，準確，高效。

浙江省地處我國東南沿海長江三角洲南翼，水產品資源豐富。近年來，由副溶血性弧菌引起的食物中毒是該省報告發病最多的食物中毒病種。相關報告顯示，浙江省細菌性食物中毒案例中， 43.06%為由副溶血性弧菌引起的食物中毒[8]。本文從20株副溶血性弧菌的基因中找出特異性高的序列，設計引物，建立一種基于熒光定量PCR快速檢測副溶血性弧菌的方法，并通過對部分市售水產品中的副溶血性弧菌污染進行檢測，測試該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

副溶血性弧菌：本實驗室從浙江、福建、山東等地分離到175株副溶血性弧菌，根據GB 4789.7—2013驗證為副溶血性弧菌，由本實驗室保藏。樣本來源覆蓋食物中毒病患和不同類別的水產品，如櫻花蝦、螠蟶、牡蠣、蛤蜊、花蛤、泥螺、盔螺、竹蟶、海螺、鯧魚、墨吉對蝦、明蝦、獨角對蝦、灰背蝦、小龍蝦、竹蟶，具有較好的代表性。

其他菌株：擬態弧菌VibriomimicusATCC33653、創傷弧菌VibriovulnificusATCC27562，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；大腸埃希菌EscherichiacoliATCC 29877、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC6633、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538、沙門氏菌SalmonellaentericCMCC50760、植物乳桿菌LactobacillusplantarumZJ191、發酵乳桿菌LactobacillusfermentumZJ236，均為本實驗室保存。

1.1.2 主要儀器

7500實時熒光定量PCR系統，賽默飛世爾科技有限公司；ABI 9700 PCR系統，賽默飛世爾科技有限公司；3K30臺式高速冷凍離心機，德國西格瑪有限公司；SW-CJ-2FD超凈臺，上海博迅公司；MJ PCT220 PCR儀，美國伯樂公司；7415 Nano核酸蛋白分析儀，英國捷恩維公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統，美國伯樂公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養

將實驗室保藏的175株副溶血性弧菌菌株，以2%的接種量接種到APW液體培養基(pH 8.5)，37 ℃培養18 h。擬態弧菌、創傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，以2%的接種量接種到LB培養基中，37 ℃培養18 h。植物乳桿菌、發酵乳桿菌，以1%的接種量接種到MRS培養基中，37 ℃培養18 h。

1.2.2 DNA提取

取含有副溶血性弧菌及對照菌株的培養液以10 000 r·min-1的速度離心2 min，用0.85%無菌生理鹽水清洗，使用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA分離試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取基因組DNA，用核酸蛋白分析儀檢測提取的DNA質量和濃度。

1.2.3 RAPD-PCR擴增

從175株副溶血性弧菌菌株中隨機選取13株進行試驗，以擬態弧菌、創傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌為對照菌株，選用S1引物(5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’)進行RAPD-PCR擴增。RAPD-PCR反應體系為25 μL: 1×PCR緩沖體系(50 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1Tris-HCl，pH值8.3)，3 mmol·L-1MgCl2，0.2 mmol·L-1dNTP，1.0 μmol·L-1S1引物，1 UTaq聚合酶及50 ng DNA模板。反應程序：94 ℃ 變性1 min，60 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸35s，45個循環；72 ℃延伸7 min。擴增產物用質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重復3次。

1.2.4 副溶血性弧菌菌株特異PCR引物設計

經RAPD-PCR檢測，在13株副溶血性弧菌中均發現了一個由S1引物擴增的普通DNA片段，將此片段純化、克隆、測序，利用Primer Premier 5.0軟件設計一對特異引物SF和SR。

1.2.5 設計引物的特異性和敏感性測試

從175株副溶血性弧菌菌株中隨機選取20株進行試驗，以擬態弧菌、創傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌為對照菌株，選用設計的引物，采用1.2.3節所述的25.0 μL PCR擴增體系進行PCR反應。PCR擴增程序： 94 ℃ 變性3 min，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物用質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重復3次。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測

在1.2.5節所述的PCR反應體系基礎上，加入1.25 μL SYBR綠色Ⅰ熒光染料(Sigma，5 mL)(20×)，從1.2.5節所選的20株副溶血性弧菌菌株中隨機挑選4株，以擬態弧菌、創傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌為對照菌株，進行熒光定量PCR擴增。PCR程序： 95 ℃預變性3 min；95 ℃變性25 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；75 ℃ 延伸30 s。

以連續稀釋10倍的已知量(5 fg～50 ng)的副溶血性弧菌基因組DNA為模板進行熒光定量PCR擴增，以副溶血性弧菌已知的菌落數對數值為橫坐標、熒光定量PCR熒光信號的熒光值為縱坐標繪制標準曲線，建立副溶血性弧菌熒光定量PCR檢測標準曲線。

1.2.7 實時熒光定量PCR方法與國家標準方法的比較

從杭州某水產市場采集新鮮蝦、蛤蜊、蟹等水產品20份，每份樣品用無菌水浸泡1 h，取1 g樣本接種10 mL APW溶液(1%生理鹽水、1%蛋白胨)，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養1 h，收集菌體，提取基因組DNA，進行實時熒光定量PCR檢測。同時，參照國家標準GB 4789.7—2013方法對樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 RAPD-PCR擴增產物的特異性

經核酸蛋白分析儀測定，所提取的副溶血性弧菌及對照菌株的DNAD280值都在1.6～1.8，可滿足試驗要求。13株副溶血性弧菌和4株對照菌株的RAPD-PCR擴增結果如圖1所示，13株副溶血性弧菌在605 bp處均有目的條帶產生，且條帶單純，而擬態弧菌、創傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌中均無對應條帶擴增，說明605 bp的條帶是副溶血性弧菌的特異性擴增片段。

2.2 副溶血性弧菌特異PCR引物設計與驗證

取2.1節所述的605 bp片段進行純化、克隆、測序，將其核苷酸序列在NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行比對，結果顯示，與副溶血性弧菌RIMD 2210633 DNA(GenBank登錄號為BA000031)的一致性為99%，在副溶血性弧菌基因組中，僅發現位于1 365 448～1 366 047 bp位置片段的一個副本。根據該片段序列，設計一對副溶血性弧菌特異性PCR引物：SF，5’-GTGACATTGACGCTTGGGATT-3’；SR，5’-TGATGGTGGACGCTTTC-3’。

選用設計的引物，對隨機挑選的20株副溶血性弧菌和4株對照菌株進行PCR擴增，結果如圖2所示，20株副溶血性弧菌在352 bp處均有目的條帶產生，而4株對照菌株中均無條帶擴增，驗證了所設計引物SF和SR的特異性。

Marker為DNA Marker DL2000，1～13為不同來源的副溶血性弧菌株，其他通道為對照菌株。箭頭所示為RAPD-PCR擴增出的副溶血性弧菌特異性片段。Marker: DL2000. Lanes 1-13， V. parahaemolyticus strains from different sources; Control: The other lanes. The arrow indicated the specific fragment amplified from V. parahaemolyticus strains by RAPD-PCR.圖1 副溶血性弧菌及對照菌株的RAPD-PCR擴增結果Fig.1 RAPD-PCR amplification result of V. parahaemolyticus and reference strains

隨機挑選4株副溶血性弧菌及8株對照菌株，以SF和SR為引物，實時定量PCR擴增的結果如圖3所示，4株副溶血性弧菌均有特異性信號，而8株對照菌株均未觀察到信號。連續稀釋的DNA模板中，當模板量為50 ng～50 fg時均可以檢測到信號，當模板量進一步降低到5 fg時，無信號產生(圖4)。經測試，純化的DNA的最小檢測靈敏度為50 fg。

2.3 實時定量PCR檢測副溶血性弧菌的標準曲線

以連續稀釋10倍的已知量的副溶血性弧菌基因組DNA為模板進行熒光定量PCR擴增，以副溶血性弧菌菌落數的對數為橫坐標，以熒光值為縱坐標繪制標準曲線(圖5)，標準曲線方程為y=-3.536x+38.04(R2=0.995 9)。

2.4 實時定量PCR方法與國家標準方法的比較

分別利用本文構建的實時定量PCR方法和國家標準中(GB 4789.7—2013)的平板菌落計數法對20份市售樣品進行檢測(表1)。實時定量PCR在20份樣品中檢出副溶血性弧菌含量大于105CFU·mL-1的樣品2份，含量在103～104CFU·mL-1的樣品4份，陽性檢出率30%。經檢驗，2種方法的結果無顯著差異。實時定量PCR方法的檢測時間為1.5 h，而平板計數法的檢測時間在48～72 h，說明實時定量PCR方法檢測水產品中的副溶血性弧菌更加快速。

Marker為DNA Marker DL2000，1～20為不同來源的副溶血性弧菌菌株，其他通道為對照菌株。Marker: DL2000. Lanes 1-20， V. parahaemolyticus strains from different sources; Control， The other lanes.圖2 引物SF和SR檢測副溶血性弧菌的特異性Fig.2 Specificity test of primers SF and SR for detection of V. parahaemolyticus

樣本1～4，副溶血性弧菌；5，擬態弧菌；6，創傷弧菌；7，大腸埃希菌；8，枯草芽孢桿菌；9，金黃色葡萄球菌；10，沙門氏菌；11，植物乳桿菌；12，發酵乳桿菌。Sample 1-4， Vibrio parahemolyticus; 5， Vibrio mimicus ;6， Vibrio vulnificus; 7， Escherichia coli; 8， Bacillus subtilis; 9， Staphylococcus aureus;10， Salmonella enteric; 11， Lactobacillus plantarum; 12， Lactobacillus fermentum.圖3 實時PCR檢測引物SF和SR的特異性Fig.3 Specificity test of primers SF and SR for real time PCR assay

圖4 不同量的副溶血性弧菌DNA模板下熒光信號的動力學Fig.4 Kinetics of fluorescence signal at different quantities of template DNA of V. parahaemolyticus

3 討論

實時熒光定量PCR技術在PCR反應體系中加入熒光染料，實時在線監測整個PCR過程[9]，具有反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強的特點[10]。熒光定量PCR可以檢測多種致病菌，近年來，在農業衛生檢測診斷中得到了廣泛應用：熒光定量PCR方法可以快速檢測原料乳中的大腸埃希菌，對原料乳中大腸埃希菌的檢測限為1.7×103CFU·mL-1[11]；采用熒光定量PCR法可快速檢測蔬菜中的沙門氏菌，沙門氏菌的最低檢出濃度為18 CFU·mL-1[12]。

圖5 實時定量PCR檢測副溶血性弧菌的標準曲線Fig.5 Standard curve for determination of V. parahaemolyticus by real-time PCR

表1 檢測樣品中副溶血性弧菌的計量結果(對數值)

關于副溶血性弧菌的檢測技術已有很多報道。有研究人員從副溶血性弧菌toxR基因中找出一段特異性高的序列設計PCR引物，建立一種常規的PCR檢測方法[13]；也有研究人員以tlh基因為靶點，通過熒光定量PCR技術檢測牡蠣組織和地幔液中的副溶血性弧菌[14]；還有研究人員以副溶血性弧菌毒素基因為靶點，通過實時PCR方法測定海水和短頸蛤勻漿中的副溶血性弧菌，檢出限為36 CFU·mL-1[15]。本文采用隨機擴增多態性分析方法鑒定特異性片段，選取目的條帶，進行克隆測序，設計出新的特異性引物，而此段序列還未被報道過。

經對比，本文建立的實時定量PCR方法快速、高效，與國家標準中給定的方法相比，顯著縮短了檢測時間，整個檢測可在2 h內完成，非常適用于水產品中副溶血性弧菌的檢測，具有推廣及應用價值。