杜仲內生細菌拮抗小麥赤霉病菌研究

陳小潔，王 其，張欣悅，丁 婷

(安徽農業大學 植物保護學院，安徽 合肥 230036)

由鐮孢屬禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)侵染引起的赤霉病主要危害小麥的穗部，會引起小麥產量下降，危害人畜健康[1-4]，使小麥產生抗藥性[5-9]，是對小麥生產威脅最大的真菌病害之一。隨著免耕、秸稈還田種植技術的推廣，化肥使用量的增加和小麥品種抗性的喪失，該病的發生逐年加重。為此，生物防治在小麥赤霉病的綜合治理中顯得更為重要。近年來，利用植物內生菌防治病害的研究得到較多關注[10-11]。在眾多的生防菌應用中，生防細菌因其種類多、生活周期短、代謝活動快且產物多、繁殖能力高、對病原菌的作用方式多樣[12]、易人工培養等特點，在生物防治中起著重要作用[13]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國名貴的中藥材之一。本試驗擬從杜仲中分離內生細菌，以小麥赤霉病菌為指示菌，對杜仲內生細菌進行拮抗細菌的篩選和鑒定。通過活體盆栽試驗研究拮抗細菌對小麥赤霉病防治情況，探討拮抗細菌對小麥赤霉病菌分生孢子萌發過程的影響，初步探索了拮抗細菌對小麥赤霉病菌的抑菌機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料

杜仲根、葉、莖的健康組織，均于2017年9月10日采自于安徽農業大學校園內種植的健康杜仲。小麥品種為安農1314，小麥赤霉病菌(F.graminearum)由安徽農業大學植物保護學院病理教研室提供。

1.1.2 培養基及藥劑

馬鈴薯葡萄糖固體培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 L。

牛肉膏蛋白胨培養基(NA)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g。

羧甲基纖維素培養基(CMC)：CMC 15 g，yeast extract 1 g，NH4NO31 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1 L。

Landy培養基： L-glutamic acid 5 g·L-1，yeast extract 1 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，MnSO4·H2O 5 mg·L-1，L-phenylalanine 2 mg·L-1，FeSO4·7H2O 0.15 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.16 mg·L-1，KH2PO41 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，調節pH至7.0。

供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑WP(江蘇三山農藥有限公司)；98%多菌靈原藥由安徽農業大學植物保護學院病理教研室提供。

練習的設計盡量避免題海戰術，做到輕負高效。為了達到這個目的，老師首先要跳入題海，精煉題型，突出重點，提高實效，將學生從繁重的課業中解放出來。

1.2 試驗方法

《東風破》典故的使用的比例大大超過了對其他常見修辭格的運用，由下面列出的統計結果(見表2.2)可以看出典故的使用幾乎貫穿全歌詞。

杜仲內生細菌分離方法參照Ding等[14]的方法，對已純化的菌株編號，轉至NA斜面培養基上，于28 ℃培養箱中培養1～2 d，然后放入4 ℃冰箱保存備用。

利用16S rDNA進行菌種鑒定，采用試劑盒法提取杜仲內生拮抗細菌DZSG23基因組。PCR擴增程序和擴增體系參照Chelo等[18]的方法。將16S rDNA PCR產物純化后送生物工程(上海)股份有限公司進行測序，所得序列通過NCBI數據庫進行Blast比對，并通過MEGA 5.1軟件對菌株進行進化分析，確定其分類地位。

采用平板對峙的方法[15]，將小麥赤霉病菌接種于PDA培養基上，在接有病原菌平板的等距離處劃線接種杜仲內生細菌，每個處理3個重復，28 ℃培養。待對照組長滿培養皿時，測量抑菌帶距離，按照如下公式計算抑制率：

菌落生長距離=測量菌落平均直徑-5 mm

抑制率(%)=

其中,r為無風險利率;q為股息收益率;σ是波動率;W(t)是一個維納過程,N(t)是與W(t)獨立且強度為λ的Poisson過程;J(t)是t時刻標的資產價格隨機跳的相對高度,滿足由文獻[14]可知Merton跳-擴散模型的特征函數為

1.2.3 生防細菌活體盆栽試驗

生防細菌菌懸液制備：將抑菌效果較好的拮抗菌接種于NA液體培養基里，37 ℃、200 r·min-1搖床培養24 h后備用(菌體濃度為1×106CFU·mL-1)。

小麥赤霉病菌分生孢子懸浮液制備：將小麥赤霉病菌接種至CMC培養基振蕩培養(25 ℃、全光照或光照12 h·d-1、180 rpm·min-1培養4 d)，獲得小麥赤霉病菌分生孢子，調節孢懸液濃度至1×105CFU·mL-1。

將小麥種子(安農1314)進行催芽處理，24 h后選取露白狀況一致的種子分別浸于滅菌NA液體培養基或拮抗菌發酵培養物中5 h[16]，然后分別播種在花盆中。每盆播種15粒，待小麥長至揚花期進行如下處理。

(1)空白對照(CK)：在長勢相當的小麥穗上噴施無菌的NA液體培養基，套袋保濕48 h后正常水肥管理。

(2)小麥赤霉病菌處理(B)：在長勢相當的小麥穗上單花滴注接種小麥赤霉病菌孢懸液，套袋保濕48 h后正常水肥管理。

1.2.5 拮抗菌株DZSG23對小麥赤霉病菌的拮抗作用

(4)多菌靈+小麥赤霉病菌處理(Y)：將配置好的50%多菌靈可濕性粉劑500倍溶液直接噴灑于小麥穗上，套袋保濕48 h后單花滴注接種小麥赤霉病菌孢懸液，繼續套袋保濕48 h后正常水肥管理。

接種小麥赤霉病菌后的第4、7、10、14、17天對不同處理組進行病害調查，計算病情指數和防效。結果見表2。隨著處理時間的延長，B、SB和Y處理組赤霉病的病情指數均呈緩慢增長趨勢，接種病原菌第10天，B處理組病情指數達到68.62，而同一生長期的DZSG23處理組小麥發病較輕，病情指數僅為40.56，與Y處理組差異顯著，但顯著低于DZSJ16處理組和DZSG09處理組；截至第17天，B處理組病情指數達到86.49，而同一生長期的DZSG23、DZSJ16和DZSG09處理組和Y處理組小麥病情指數分別為62.73、78.48、71.12和53.27。上述結果說明，在小麥中引入DZSG23菌株可顯著提高小麥植株對赤霉病的抗性，降低赤霉病的發病率。

滅菌載玻片中央放置15 mm × 10 mm的無菌PDA薄膜一塊，分別接種DZSG23和小麥赤霉病菌于PDA薄膜兩平行邊的中點，放置于28 ℃恒溫培養箱內保濕培養，逐天鏡檢兩菌的相互作用并顯微拍照。

1.2.4 DZSG23的種群鑒定

1.2.2 拮抗細菌的篩選

if(oldState!=null&&value=="initiated")OnStateInitiatedChange(myEventArgs);

(3)拮抗菌+小麥赤霉病菌處理組(SB)：將拮抗菌菌懸液直接噴灑于小麥穗上，套袋保濕48 h后單花滴注接種小麥赤霉病菌孢懸液，套袋保濕48 h后正常水肥管理。

1.2.6 拮抗菌株DZSG23對小麥赤霉病菌分生孢子萌發的影響

國家之強弱，視教育發達與否為標準。東西各國規定義務教育，凡學齡兒童已達就學之期，非有不得已事故不得廢學，否則罪其父母，此教育之所以溥及而國乃以強盛。方今民國初定，百端待理，顧尤以普及教育為根本之要圖。而謀普及教育，須從調查學齡兒童入手，某地應添設學校幾所，某地應需經費若干，種種設施，皆恃是以為準則。而以學齡兒童之人數比較就學差數之多少，尤足覘各地文化之遲速。[13]

問：我奶奶85歲，有痔瘡而且腹瀉嚴重，幾乎吃點東西就要上廁所，肚里存不住東西，這樣對老人身心健康不利，家人很擔心，去醫院也查不出什么問題。請問楊老師如何治療，或是吃點什么補品？

DZSG23菌懸液和次級代謝產物制備：拮抗菌DZSG23接種于NA液體培養基，37 ℃、200 r·min-1搖床培養24 h，離心后分別取上清發酵液和菌體。發酵液凍干為次級代謝產物，菌體無菌水重懸(菌懸液濃度為1×106CFU·mL-1)，-20 ℃冰箱備用。

CMC培養基培養小麥赤霉病菌的分生孢子，病原菌孢懸液濃度調節至1×105CFU·mL-1。試驗設置4個處理：空白對照、98%多菌靈、DZSG23菌懸液、DZSG23次級代謝產物。其中，98%多菌靈和DZSG23次級代謝產物分別與0.5 mL 1×105CFU·mL-1的赤霉病菌孢懸液和適量PDA液體培養基混合，終體積為5 mL。使98%多菌靈終濃度達到5、10 μg·mL-1，DZSG23次級代謝產物終濃度達到5、10 mg·mL-1，赤霉病菌孢懸液濃度達到1×106CFU·mL-1。置于28 ℃培養箱中，分別于培養6、12、24、30和36 h觀察不同處理組的小麥赤霉病菌分生孢子萌發、分生孢子芽管形態和菌絲體的形成等，測定小麥赤霉病菌分生孢子的萌發率和畸形率。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的分離篩選

從杜仲的根、莖、葉中共分離得到104株內生細菌，如表1所示。采用16S rDNA初步鑒定出104株內生細菌分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)6個屬，菌株的GenBank登錄號如表1所示。其中，芽孢桿菌屬(Bacillus)內生細菌共39株，占分離內生細菌總數的37.50%，在杜仲的根、莖、葉中廣泛分布。

采用平板對峙法測定104株杜仲內生細菌對小麥赤霉病菌的抑菌活性，結果如表1所示。抑菌率超過60%的分別為DZSG09、DZSJ16、DZSG23，其中，DZSG23對小麥赤霉病菌的抑制率達到了69.04%。后續試驗選擇上述3株菌株開展對小麥赤霉病防治的盆栽試驗。

表1 杜仲內生細菌對小麥赤霉病菌的抑制作用

續表1

表中所列數據為3個重復的平均值。

Data listed in the table were the average of 3 replicates.

2.2 拮抗細菌對小麥赤霉病菌的盆栽防效試驗

每種處理設3盆作為重復，分別在接種小麥赤霉病菌后的第4、7、10、14、17天進行病情調查。小麥赤霉病的病情嚴重度分級標準參考李洪連等[17]的方法，公式如下：

1.2.1 杜仲內生細菌的分離

2.2 兩組右側基底節區各代謝物比值的比較 結果(表1，圖1)表明：HIE組患兒中右側基底節區NAA/Cho、NAA/Cr明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；HIE組患兒中右側基底節區Lac/Cr高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。

隱喻是大學生心理活動的重要表現形式。探索大學生隱喻可以揭示大學生內心的心理取向。此研究主要是了解大學生的隱喻意識以及使用隱喻的價值取向。主要研究以下問題：

2.3 杜仲內生細菌的種群鑒定

以DZSG23基因組DNA為模板，PCR擴增16S rDNA序列并測序。NCBI序列比對發現，DZSG23的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌B.subtilis(KC146707.1)的核苷酸序列相似性最高；采用DNAMAN軟件，構建菌株16S rDNA序列系統發育樹，發現DZSG23與枯草芽孢桿菌B.subtilis聚成一個分支，說明菌株DZSG23與芽孢桿菌屬各菌株親緣關系最近，而與腸桿菌屬各菌株的親緣關系相對較遠(圖1)。因此，初步鑒定菌株DZSG23為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)株系。

究竟什么原因造成“放炮”呢？能不能降服甚至消滅“炮老虎”，打破外國專家“放炮難免”的斷言呢？高壓聚乙烯車間干部員工絞盡了腦汁，董松江也在暗中較勁。

2.4 DZSG23對小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制

在接種小麥赤霉病菌4 d后，對照平板上小麥赤霉病菌菌絲體生長旺盛且長滿整個平板(圖2-a)，而在接種芽孢桿菌DZSG23的平板上小麥赤霉病菌受到抑制，形成明顯的抑菌帶(圖2-b)。對抑菌帶內的小麥赤霉病菌菌絲進行顯微觀察發現，小麥赤霉病菌菌絲明顯膨大、扭曲變形(圖2-d箭頭所示)，而對照的菌絲形態正常，無異常變化(圖2-c)。

（4）Cl-在 H-103樹脂上的吸附熵變 ΔS＞0，表明在Cl-的吸附過程中同時存在著溶劑的解吸，吸附熵變ΔS變化很小，ΔS變化范圍為0.004～0.1 k J·mol-1。

表2 接種赤霉病菌不同時間小麥赤霉病的病情指數

“—”表示無此項。同列數據后無相同小寫字母表示0.05水平上差異顯著。

“—” means no defense. Data without the same letters in a column indicated significant differences according to Duncan’s multiple range test (α=0.05)

圖1 DZSG23菌株16S rDNA序列的進化分析Fig.1 Phylogenetic tree of the strain DZSG23 based on 16S rDNA

2.5 拮抗菌株DZSG23對小麥赤霉病菌分生孢子的影響

2.5.1 分生孢子萌發

不同時間段，以空白對照為陰性對照，分別檢測98%多菌靈、DZSG23菌懸液、DZSG23次級代謝產物處理組中小麥赤霉病菌分生孢子的萌發率，結果如圖3所示。不同處理組小麥赤霉病菌的分生孢子萌發速率存在較明顯差異，98%多菌靈處理組和DZSG23菌懸液一定程度上均能延緩分生孢子萌發時間。截至第36小時，5、10 μg·mL-1的98%多菌靈處理后的小麥赤霉病菌分生孢子萌發率分別為98.56%和93.22%，DZSG23菌懸液(1×106CFU·mL-1)處理的小麥赤霉病菌分生孢子萌發率為98.04%，與多菌靈處理組無明顯差異；而DZSG23次級代謝產物處理組對小麥赤霉病菌分生孢子萌發的抑制作用較小，病原菌分生孢子在12 h后幾乎全部萌發。說明，DZSG23菌懸液可減緩小麥赤霉病菌分生孢子的萌發速率，但36 h后不能抑制孢子的萌發，而其次級代謝產物對小麥赤霉病菌分生孢子的萌發幾乎無影響。

“醫院從2015年開始推行‘崗位目標責任書’，就是為了規避部門制定目標時的種種問題。從那時，我們就提出，由醫院整體核定目標。”韓建峰表示，醫院結合西安交通大學辦學定位、醫院五年規劃等制定目標，把目標進行分解，細化到每一年，使醫院發展有比較具體的目標。每一年的落實中，每個職能科室結合實際情況制定目標。

a，小麥赤霉病菌培養4 d；b，菌株DZSG23與小麥赤霉病菌對峙培養4 d；c，正常的小麥赤霉病菌菌絲形態；d，變形的小麥赤霉病菌菌絲形態。a， F. graminearum cultured for 4 days; b， Confront antibiotic culture experiment of strain DZSG23 and F. graminearum for 4 days; c， Shape of normal mycelia of F. graminearum; d， Shape of deformed mycelia of F. graminearum.圖2 菌株DZSG23與小麥赤霉病菌的對峙培養結果Fig.2 Confront antibiotic culture experiment of strain DZSG23 and F. graminearum

a，多菌靈處理；b，菌懸液處理；c，次級代謝產物處理。a， Carbendazol; b， DZSG23 suspension; c， Secondary metabolites of DZSG23.圖3 不同處理對小麥赤霉病菌分生孢子萌發速率的影響Fig.3 Effects of different treatments on the conidiospore germination rate of F. graminearum

2.5.2 分生孢子畸形率

以空白對照為陰性對照，分別檢測98%多菌靈、DZSG23菌懸液、DZSG23次級代謝產物處理組中小麥赤霉病菌分生孢子的畸形率，結果如圖4所示。隨著處理時間的延長，不同濃度多菌靈的添加均可以快速增加小麥赤霉病菌分生孢子的畸形率，截至第36小時，5、10 μg·mL-1多菌靈處理組赤霉病菌分生孢子致畸率分別為97.63%和96.29%；DZSG23菌懸液(1×106CFU·mL-1)也可迅速提高小麥赤霉病菌分生孢子的畸形率，處理6 h，畸形率達14.50%，處理36 h，畸形率升高至57.70%；DZSG23次級代謝產物的致畸作用相對較低，截至第36小時，5、10 mg·mL-1次級代謝產物處理組對赤霉病菌分生孢子致畸率僅分別為30.46%和36.67%。處理6 h不同處理組中的赤霉病菌分生孢子形態如圖5所示，空白對照組的赤霉病菌分生孢子大多從頂端萌發，萌發形成的菌絲光滑而均勻；與此同時，多菌靈、DZSG23菌懸液及其次級代謝產物處理的病原菌分生孢子及其芽管均出現膨大、扭曲和畸形等現象。

針對實際訓練中常常存在過擬合的問題,本文采用 Dropout方法來對神經網絡進行正則化[14]。由于大棚中環境變量數據量大且變化緩慢,所以在訓練過程中以0.1的概率隨機丟棄網絡中的一些神經元以及相互之間的權重連接,提升模型的泛化能力,不易對訓練數據過擬合。

a，多菌靈處理；b，菌懸液處理；c，次級代謝產物處理。a， Carbendazol; b， DZSG23 suspension; c， Secondary metabolites of DZSG23.圖4 不同處理對小麥赤霉病菌分生孢子畸形率的影響Fig.4 Effects of different treatments on conidiospore deformity rate of F. graminearum

a，空白對照；b，多菌靈(4 μg·mL-1)處理；c，菌懸液(1×106 CFU·mL-1)處理；d，次級代謝產物(10 mg·mL-1)處理。a， Blank control; b， Carbendazol(4 μg·mL-1); c， DZSG23 suspension(1×106 CFU·mL-1); d， Secondary metabolites of DZSG23(10 mg·mL-1). 圖5 不同處理6 h后的分生孢子及其芽管畸形Fig.5 Abnormality of conidia and their germ tubes under different treatments for 6 h

3 討論

本研究以小麥赤霉病菌為靶標，篩選獲得一株具有較高抑菌活性的杜仲內生細菌DZSG23，將其引入小麥，可明顯提高小麥植株對赤霉病的抗性，減少赤霉病對小麥的危害。進一步的研究表明，芽孢桿菌DZSG23可引起小麥赤霉病菌菌絲的腫脹、膨大，降低孢子萌發速率，并使分生孢子及其萌發出的芽管畸形。該試驗結果為抗小麥赤霉病拮抗菌的篩選及生防機理研究提供了理論基礎。

植物內生菌作為一種新型的微生物資源，近年來在植物病害生物防治中發揮著重要的作用[19-21]。杜仲作為中國傳統的藥用植物，不容易被植物病蟲害感染，具有抗菌、抗腫瘤、增強免疫功能等藥理活性[22]，因此，從杜仲中分離篩選拮抗內生菌在實際生產中具有較好的應用前景。本研究以安徽農業大學校園中生長多年的健康杜仲植物為材料，進行內生細菌的分離純化，最終獲得內生細菌104株，分屬于6個屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)，這與已有的從杜仲健康組織中分離到的內生細菌種群相比[23]，僅有短芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬等少數種群一致，而分離出的其他細菌的數量和種類均有差異。究其原因，一方面可能是由于內生菌依附的寄主植物受生長環境、氣候等外界因素的影響，其生長狀況和生理特性均存在差異；另一方面，本試驗以NA培養基作為內生細菌分離純化的培養基，但由于不同菌株要求的營養條件不同，因此，可能導致一些生長條件比較苛刻的專性內生細菌難以生長，反映在試驗結果上，即分離出的杜仲內生細菌在種群數量上與相關文獻報道均存在一定的差異。

該研究中獲得的對小麥赤霉病菌具有較好拮抗活性的DZSG23，經16S rDNA鑒定為芽孢桿菌屬微生物。芽孢桿菌作為重要的生物防治資源，廣泛存在于土壤等自然環境中，亦是常見的植物內生菌，在玉米、水稻等多種植物中均有其分布[24-25]，其可通過產生抑菌物質、競爭作用、誘導寄主植物產生抗病性等多種機理抑制植物病原菌生長，在防治植物病害中發揮重要作用。如楊瑞先等[26]從牡丹根部組織中分離出的2株解淀粉芽孢桿菌Md31和Md33均具有合成脂肽類物質的能力，且2個菌株的脂肽類粗提物也具有較強的體外抑菌活性。姬婧媛等[27]發現植物內生枯草芽孢桿菌菌株E1R-j產生的抗菌脂肽類物質可對小麥全蝕病菌菌絲有抑制作用，可使菌絲細胞畸形、細胞壁潰解、細胞質外滲等。本研究發現，芽孢桿菌DZSG23不僅可引起小麥赤霉病菌菌絲的腫脹、膨大，還可降低孢子萌發速率，引起分生孢子細胞及其芽管產生畸形。引起上述現象的原因是否是芽孢桿菌屬微生物DZSG23產生的抑菌物質而導致的尚不明確，因此后續試驗中，將開展DZSG23相關脂肽類抑菌物質的研究，在明確拮抗菌株DZSG23所產生的抑菌物質種類的同時，明晰其脂肽類物質的抑菌活性。此外，由DON毒素引起的麥粒中毒是我國和其他一些國家最主要的真菌性食物中毒之一，目前，DON毒素的分析檢測及毒性研究倍受重視[28-29]。該研究僅開展了DZSG23菌株對小麥赤霉病的盆栽防控評價及其對赤霉病菌菌絲和分生孢子的影響，而DZSG23菌株的引入能否抑制小麥赤霉病菌毒素的產生尚不清楚。因此，后續試驗中將利用高效液相色譜法對其開展深入研究，明確拮抗菌株對赤霉病菌毒素產生的影響機制。

迄今為止，小麥赤霉病仍以噴施化學殺菌劑為主，然而，長期大量的施用殺菌劑，不僅誘發產生抗藥禾谷鐮孢菌菌株[6]、農藥殘留超標[30]，還促進毒素生物合成[31]，也造成環境污染。近年來，大量的研究工作圍繞小麥赤霉病拮抗生防菌的篩選和相關抑菌機制進行展開，并獲得了較多的拮抗微生物。管章玲等[32]從多種植物體和土壤中分離出30株對禾谷鐮刀菌有明顯抑制作用的菌株，菌株NS-QCT的抑菌活性最強。王建偉[33]發現其篩選的菌株AF0907是通過分泌某種抗菌物質來抑制小麥赤霉病菌的，初步鑒定該抗菌物質為蛋白質。且部分微生物已經獲得農藥登記許可證[34]，但是多數拮抗微生物雖在實驗室條件下能表現出良好的抑菌活性，但在大田條件下，由于環境條件的改變，不能很好地適應田間微環境，無法快速生長繁殖，從而難以發揮抑菌作用，導致生防效果不盡理想。因此，提高生防菌在田間地上部位和根際的定殖、快速繁殖能力，是拮抗微生物田間施用中需要考慮并解決的問題。后續研究中，該試驗計劃利用基因標記或抗藥性標記等技術，進一步研究DZSG23在植株的定殖動態，提高其在小麥中的定殖效能。