泌乳初期奶牛相關(guān)脂肪因子及生理生化指標(biāo)與脂肪肝的相關(guān)性

朱潁琨，肖勁邦，錢柏霖，姜思汛，尤留超，張 鉞，劉 紅，馬 莉，曹隨忠，余樹民，沈留紅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/奶牛疾病研究中心，四川 成都 611130)

脂肪肝是泌乳初期奶牛常見的一種營(yíng)養(yǎng)代謝病，又稱肥胖奶牛綜合癥，是指泌乳初期母牛(尤其是產(chǎn)后7～14 d)因干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)下降、泌乳的啟動(dòng)及DMI上升速度低于泌乳量上升速度，機(jī)體能量供應(yīng)不足而引起能量負(fù)平衡(negative energy balance，NEB)，導(dǎo)致脂肪分解生成大量游離脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)。NEFA被肝臟吸收后，合成大量甘油三酯(triglyceride，TG)，蓄積于肝臟，最終導(dǎo)致能量代謝障礙性疾病[1-3]。目前，泌乳初期奶牛脂肪肝多發(fā)生于高產(chǎn)奶牛，發(fā)病率高達(dá)50%，且呈不斷上升趨勢(shì)[4]，由于其病程長(zhǎng)且難以治療，嚴(yán)重影響奶牛生產(chǎn)性能、繁殖性能及免疫功能，給奶牛養(yǎng)殖行業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。脂肪因子是由脂肪等組織分泌的活性物質(zhì)，包括脂聯(lián)素(adiponectin，ADPN)、瘦素(leptin，LP)、抵抗素(resistin)、內(nèi)脂素(visfatin)、網(wǎng)膜素(omentin)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等100余種，在糖、脂代謝調(diào)控中有重要作用，與能量代謝性疾病有著密切聯(lián)系[6]。研究表明，ADPN、LP、TNF-α和白介素6(interleukin 6，IL-6)等在人、小鼠和大鼠的脂肪肝發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮不同程度的作用[7-9]，但在奶牛上還未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究旨在探究泌乳初期脂肪肝奶牛ADPN、LP、TNF-α和IL-6與肝功能、能量代謝指標(biāo)的相關(guān)性，為揭示奶牛血清脂肪因子對(duì)脂肪肝的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選用四川某規(guī)?；膛?chǎng)半封閉統(tǒng)一飼舍，體質(zhì)量(510±47)kg、1～4胎次泌乳初期的荷斯坦奶牛64頭，自由采食、飲水，統(tǒng)一全混合日糧飼喂。

1.2 試驗(yàn)試劑

NEFA、血糖(Glu)、β-羥基丁酸(BHBA)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；ADPN、LP、TNF-α、IL-6雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒，北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血清收集

于奶牛產(chǎn)后第7、14天，早飼前尾靜脈采血10 mL，所采血樣置于無抗凝劑的離心管中，室溫靜置1 h，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，-70 ℃保存，待檢。

1.3.2 脂肪肝奶牛判定

根據(jù)Reid等[10]提出的脂肪肝判定公式，即Y=-0.51-0.003NEFA+2.84Glu-0.0528AST。當(dāng)Y<0時(shí)為重度脂肪肝；當(dāng)01時(shí)為正常。產(chǎn)后第14天Y<1的被納入脂肪肝組，Y>1的被納入對(duì)照組，其中脂肪肝組28頭，對(duì)照組36頭。

1.3.3 脂肪因子和生化指標(biāo)檢測(cè)

按照試劑盒說明書檢測(cè)相關(guān)脂肪因子和血清生化指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2007進(jìn)行初步處理，用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性使用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清部分脂肪因子檢測(cè)結(jié)果

產(chǎn)后第7、14天，脂肪肝組奶牛血清瘦素水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。產(chǎn)后第14天，脂肪肝組奶牛脂聯(lián)素水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

產(chǎn)后第7、14天，脂肪肝組奶牛血清血糖、總蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、游離脂肪酸和β-羥基丁酸水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。產(chǎn)后第7天，脂肪肝組奶牛球蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而白球比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。產(chǎn)后第14天，脂肪肝組奶牛白蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而總膽紅素與直接膽紅素水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表1 血清中LP、ADPN、TNF-α與IL-6檢測(cè)結(jié)果

*表示相同時(shí)間組間差異顯著(P<0.05)。下表同。

* indicated significant difference (P<0.05) between groups at the same time. The same as below.

表2 血清中部分生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 血清瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6間的相關(guān)性

奶牛血清中瘦素與脂聯(lián)素呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與TNF-α呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；脂聯(lián)素與TNF-α呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；TNF-α與IL-6呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表3)。

2.4 血清瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6與部分能量代謝指標(biāo)的相關(guān)性

奶牛血清中瘦素與血糖、TNF-α與β-羥基丁酸之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；TNF-α與游離脂肪酸、IL-6與游離脂肪酸之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；瘦素與β-羥基丁酸、脂聯(lián)素與游離脂肪酸、脂聯(lián)素與β-羥基丁酸、TNF-α與血糖之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；瘦素與游離脂肪酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表4)。

表3 血清中瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6間的相關(guān)性

2.5 血清瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6與肝功指標(biāo)的相關(guān)性

奶牛血清中瘦素與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；瘦素與總蛋白、脂聯(lián)素與總蛋白之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；瘦素與白蛋白、瘦素與白球比、脂聯(lián)素與白蛋白、TNF-α與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、TNF-α與直接膽紅素、IL-6與谷丙轉(zhuǎn)氨酶之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；瘦素與總膽紅素、瘦素與直接膽紅素、脂聯(lián)素與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、TNF-α與總蛋白、TNF-α與白蛋白、IL-6與總蛋白、IL-6與白蛋白之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表5)。

表4 血清中瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6與部分能量代謝指標(biāo)之間的相關(guān)性

表5 血清中瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6與部分肝功指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

3.1 泌乳初期脂肪肝奶牛血清瘦素水平與脂肪肝的相關(guān)性

瘦素主要由機(jī)體白色脂肪組織產(chǎn)生，可反映機(jī)體能量?jī)?chǔ)備與攝入的急性變化[11]，可通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用穿越血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。研究表明，瘦素的其他受體亞型如LepRa等可參與瘦素血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。瘦素作為信號(hào)分子，其水平與機(jī)體外周能源供給情況呈正相關(guān)，具有將外周能量狀態(tài)傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)控食欲和新陳代謝的作用。

奶牛脂肪肝的發(fā)病機(jī)理尚不明確，但目前較為認(rèn)同的假說是能量負(fù)平衡可引起體脂動(dòng)員，導(dǎo)致大量的甘油三酯合成并蓄積在肝臟而發(fā)病。泌乳初期奶牛經(jīng)歷妊娠、分娩和啟動(dòng)泌乳等生理應(yīng)激，尤其妊娠后期和泌乳初期奶牛因干物質(zhì)攝入減少、能量需求增加易導(dǎo)致NEB發(fā)生[13]。研究表明，干物質(zhì)攝入量越低，泌乳期能量負(fù)平衡越嚴(yán)重，血液循環(huán)瘦素水平越低[14-15]。本研究中，產(chǎn)后第7、14天，脂肪肝組奶牛血清中瘦素水平均顯著低于對(duì)照組，暗示奶牛泌乳初期NEB可能是奶牛產(chǎn)生脂肪肝的原因之一。

本研究結(jié)果顯示，奶牛血清中瘦素與血糖呈極顯著正相關(guān)，與游離脂肪酸、β-羥基丁酸呈顯著負(fù)相關(guān)，與鄭家三等[16]、何寶祥等[17]的研究結(jié)果一致。Malloy等[18]的研究結(jié)果也表明，瘦素缺乏小鼠體內(nèi)游離脂肪酸顯著增加。但在研究中使用高脂日糧可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肥胖與脂肪肝，并表現(xiàn)出高血糖、高瘦素抵抗、高血脂、高胰島素抵抗、高游離脂肪酸，與奶牛脂肪肝發(fā)病時(shí)低血糖、低瘦素的狀況有較大差別，提示奶牛泌乳初期脂肪肝與高脂飲食導(dǎo)致的脂肪肝發(fā)病原因不同。

瘦素能夠調(diào)控機(jī)體代謝，限制甘油三酯在非脂肪細(xì)胞(包括肝細(xì)胞)中的儲(chǔ)存，從而影響肝臟功能[19]。瘦素水平過高，易引起瘦素抵抗，使瘦素敏感性降低，導(dǎo)致機(jī)體糖脂代謝紊亂[20]。Okamatsu等[21]的研究表明，超重兒童瘦素水平與肝臟損傷程度顯著高于正常兒童。本研究結(jié)果顯示，瘦素與AST、TBIL、DBIL、TP呈顯著負(fù)相關(guān)，與ALB呈顯著正相關(guān)，與之前的研究不完全相同。這進(jìn)一步提示了泌乳初期奶牛脂肪肝的發(fā)病機(jī)制與傳統(tǒng)意義上的攝入脂質(zhì)過剩導(dǎo)致的脂肪肝不同，印證了NEB導(dǎo)致脂肪動(dòng)員，脂肪沉積于肝臟而發(fā)病的假說，與此同時(shí)，NEB所表現(xiàn)出的血糖降低也會(huì)引起瘦素水平降低，進(jìn)一步加劇肝臟的TG合成，使得TG沉積，引發(fā)脂肪肝，影響肝功能。

3.2 泌乳初期脂肪肝奶牛血清脂聯(lián)素水平與脂肪肝的相關(guān)性

脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌的一種分子量為30 kD的蛋白多聚體[22]，能夠促進(jìn)游離脂肪酸的氧化，改善胰島素敏感性，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[23]。Jarrar等[24]和Hui等[25]的研究表明，非酒精性脂肪肝患者循環(huán)脂聯(lián)素水平顯著低于健康人，認(rèn)為低血漿脂聯(lián)素可導(dǎo)致血漿甘油三脂和游離脂肪酸的升高與脂質(zhì)在肝臟中的蓄積。另有研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素缺失小鼠體內(nèi)2種脂肪酸合成的限速酶(乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合酶)表達(dá)量增加，并且肝脂肪變性相比野生型小鼠更嚴(yán)重[26]。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)后第7天，脂肪肝組奶牛血清中脂聯(lián)素水平低于對(duì)照組，但差異不顯著；產(chǎn)后第14天，脂肪肝組血清中脂聯(lián)素水平顯著低于對(duì)照組，與上述學(xué)者在人鼠研究報(bào)道中趨勢(shì)一致。

Zou等[27]在人上研究表明，兒童發(fā)育時(shí)期脂聯(lián)素水平下降，會(huì)導(dǎo)致血清游離脂肪酸上升，進(jìn)而引發(fā)脂肪代謝紊亂，易導(dǎo)致兒童肥胖癥。Lavoie等[28]在小鼠上的研究也有相似的結(jié)果。張輝等[29]研究結(jié)果顯示，高濃度游離脂肪酸和β-羥基丁酸對(duì)牛脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)具有抑制作用。本研究結(jié)果也顯示，奶牛血清中脂聯(lián)素與游離脂肪酸和β-羥基丁酸呈顯著負(fù)相關(guān)，提示泌乳初期奶牛體內(nèi)由于脂肪動(dòng)員導(dǎo)致的循環(huán)游離脂肪酸水平上升導(dǎo)致脂聯(lián)素合成被抑制，進(jìn)一步加劇脂肪動(dòng)員，提高脂肪肝風(fēng)險(xiǎn)。

脂聯(lián)素能減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，正常水平的脂聯(lián)素意味著較低的肝臟疾病風(fēng)險(xiǎn)[22]。Yokoyama等[30]對(duì)791名日本工人的研究發(fā)現(xiàn)，AST活性增高者的脂聯(lián)素水平顯著低于AST活性正常的人，提示脂聯(lián)素水平與AST活性成負(fù)相關(guān)。Kusumawocti等[31]對(duì)37名肥胖兒童的研究也有相同的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，泌乳初期奶牛血清中脂聯(lián)素與AST呈顯著負(fù)相關(guān)，與TP和ALB呈顯著正相關(guān)，推測(cè)是由于脂聯(lián)素水平下降，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，進(jìn)而損傷肝臟功能。

3.3 泌乳初期脂肪肝奶牛血清TNF-α水平與脂肪肝的相關(guān)性

TNF-α是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，由巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)[32]，直到1993年人們才發(fā)現(xiàn)其對(duì)脂肪代謝也有重要調(diào)控作用。Hui等[25]對(duì)非酒精性、單純性脂肪肝及正常肝臟進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)非酒精性和單純性脂肪肝中血清TNF-α水平較高。Ajmal等[33]對(duì)72名脂肪肝患者和32名健康者血清TNF-α進(jìn)行檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后第7、14天，脂肪肝組奶牛血清TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組，提示TNF-α水平的上升與奶牛脂肪肝發(fā)病有較強(qiáng)相關(guān)性。TNF-α可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分解和游離脂肪酸的釋放，Castro等[34]發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因敲除小鼠由于體內(nèi)缺乏TNF-α，導(dǎo)致促脂分解作用消失，游離脂肪酸水平也降低。本研究中，TNF-α與血糖呈顯著負(fù)相關(guān)，與游離脂肪酸和β-羥基丁酸顯著正相關(guān)，與上述學(xué)者在人鼠上報(bào)道的趨勢(shì)一致，提示奶牛TNF-α水平上升會(huì)加劇脂肪動(dòng)員，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)脂肪肝。

TNF-α不僅影響脂質(zhì)代謝，還可通過上調(diào)肝細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein-2，UCP2)的表達(dá)影響線粒體能量代謝，產(chǎn)生大量活性氧簇，引起脂質(zhì)過氧化，損傷肝細(xì)胞，進(jìn)而引起肝功能異常[35-36]。韓旭等[37]研究顯示，TNF-α較高時(shí)，肝功能損傷更為嚴(yán)重。Hughes[38]對(duì)肝功能異常者使用TNF-α拮抗劑后，發(fā)現(xiàn)患者肝功能得到明顯改善。本研究顯示，TNF-α與AST和DBIL呈顯著正相關(guān)，與TP和ALB呈顯著負(fù)相關(guān)，與上述學(xué)者研究結(jié)果相一致，推測(cè)TNF-α水平上升可通過一系列途徑影響肝細(xì)胞生理活動(dòng)，引起肝功能指標(biāo)的改變。

3.4 泌乳初期奶牛血清IL-6水平與脂肪肝的相關(guān)性

IL-6是由脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多細(xì)胞分泌的一種促炎因子[39-40]。內(nèi)臟脂肪是IL-6分泌的重要器官，其產(chǎn)生的IL-6至少是皮下脂肪的3倍。IL-6在脂肪肝發(fā)生及發(fā)展過程中的作用尚存爭(zhēng)論。金世祿等[41]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝患者血清IL-6水平顯著升高，且IL-6與胰島素抵抗呈顯著正相關(guān)。而Hong等[42]研究結(jié)果則顯示，注射IL-6可改善小鼠肥胖和脂肪肝。本研究中，產(chǎn)后第7、14天，脂肪肝組奶牛血清中IL-6水平高于對(duì)照組，但差異不顯著，推測(cè)主要是檢測(cè)時(shí)間處于疾病初期，尚未造成嚴(yán)重的肝臟的功能損傷，因而并未產(chǎn)生顯著的IL-6水平差異。此外，奶牛血清中IL-6與游離脂肪酸呈顯著正相關(guān)，與王軍英等[43]、陳華等[44]在人和大鼠上研究結(jié)果一致，推測(cè)泌乳初期奶牛IL-6水平上升，可直接或間接的導(dǎo)致胰島素抵抗，從而引起機(jī)體糖脂代謝紊亂，血液中游離脂肪酸上升，過量的游離脂肪酸進(jìn)入肝臟，引發(fā)脂肪肝。

IL-6不僅參與胰島素抵抗的發(fā)生，同時(shí)也可介導(dǎo)肝臟的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，損害肝臟功能[45]。韓旭等[37]報(bào)道，血清IL-6水平隨肝功能受損程度增加而上升，且與TBIL、ALT呈顯著正相關(guān)，與ALB呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IL-6與ALT呈顯著正相關(guān)，與TP、ALB呈顯著負(fù)相關(guān)，與上述學(xué)者在人上的報(bào)道基本一致，表明IL-6參與了奶牛脂肪肝肝臟損傷的過程，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。