辣椒花藥開放式培養及不同基因型對花藥培養的影響

楊博智，周書棟，董亞靜，劉榮云，歐立軍，劉 峰，鄭井元，馬艷青*

（1.湖南省農業科學院蔬菜研究所，湖南 長沙 410125； 2.湖南湘研種業有限公司，湖南 長沙 410100）

辣椒（Capsicum annuumL.）是一種重要的蔬菜作物，適應性很強，廣泛栽培于世界各地。近年來，我國辣椒產業發展迅速，辣椒種植面積基本穩定在150萬～200萬hm2，居蔬菜種植首位[1]。創制優異種質資源是選育辣椒新品種的重要基礎，而花藥培養是創新種質資源的一種重要手段，不僅能縮短常規雜交育種所需的年限，提高選種效率，而且還能充分表現各種配子組合的基因型類型，在育種和基因工程研究中都具有很大的潛力。辣椒花藥培養研究開始較早，采用花藥培養獲得單倍體植株的報道較多[2-6]。我國應用花藥培養技術選育出的海花系列花藥培養辣椒品種已應用推廣。

對辣椒花藥進行培養時，用于單倍體培養的花蕾的花萼與花瓣齊平（此時小孢子處于單核靠邊期），常規滅菌方式無法對花萼與花瓣間隙中的細菌徹底滅菌，接種后花藥染菌率仍然居高不下；特別是中國南方地區，由于夏季高溫多雨，各種菌類大量滋生，雖然此時的辣椒花藥最適宜誘導胚狀體產生，但過高的污染率導致了花藥培養效率變低。常規辣椒花藥接種方法是在超凈工作臺上進行，用尖頭鑷子挑開滅菌后的花蕾，夾取花藥接種至培養基中。辣椒花藥較小（花藥寬1 mm左右），鑷子夾取花藥易夾傷或夾死花藥，且該方法耗時長，所需人工成本高。另外，基因型特異性強也是限制花藥培養技術在辣椒遺傳改良中廣泛應用的因素[7-9]。

本研究通過改進花蕾滅菌和花藥接種方式，以及往培養基中添加抑菌劑，簡化了花藥培養技術流程，既能提高花藥培養操作效率，又有效降低了花藥染菌率；同時，采用該方法比較23個辣椒品種進行的花藥培養效果，篩選出高再生頻率的辣椒品種，以期為提高辣椒花藥培養效率，加快辣椒花藥培養技術的實用化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

辣椒品種為博辣紅牛、博辣5號、博辣8號、博辣紅艷、博辣瑞美、基地火辣、金線王、博辣紅星、興蔬綠劍、H15、215、博辣天星、新粗條椒、綠金線、春研13號、37-74、908、福湘錦繡、福湘佳玉、恒豐圣美、辣八螺絲王、久保田、新優早王，均由湖南省蔬菜研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒花藥培養的方法探討

1.2.1.1 花蕾滅菌 于博辣紅牛現蕾期，采集花萼與花瓣齊平或花萼微露出花瓣的花蕾，放入自封口袋。置于4 ℃冰箱中低溫預處理 48 h。取出花蕾，分成2份，一份直接用于滅菌，另一份用尖頭鑷子繞離花蕾頂端約3/4處輕輕劃圈，剝去花蕾頂部的花萼，露出青綠色花瓣，再滅菌。滅菌方式為將花蕾置于50%的84滅菌液中滅菌10 min，再用無菌水沖洗2～3次。花藥接種采取用鑷子夾取的常規方法。接種14 d后統計花藥染菌率和死亡率，確定最佳滅菌方式。

1.2.1.2 花藥接種 對剝去3/4花萼再用50%的84滅菌液消毒10 min的花蕾，采用2種方式接種花藥。處理組用浸泡在75%酒精中的鑷子尖微微挑開花瓣，再徒手輕輕擠壓花瓣，使花藥自然脫落于培養基表面；對照組采用鑷子直接夾取花藥接種至培養基表面。接種14 d后統計花藥染菌率、死亡率，確定最佳滅菌方式。

1.2.1.3 抑菌劑種類和濃度選擇 選擇兩性霉素B和氨芐青霉素作為抑菌劑。兩性霉素B和氨芐青霉素濃度處理見表1。將博辣紅牛花藥分別接種至添加0.5 mg/L KT、2.5 mg/L NAA、不同種類和濃度抑菌劑的NTH培養基中，置于恒溫培養箱中（35.0±0.5）℃黑暗培養 8 d，再轉入培養室（25.0±0.5）℃暗培養至有白色胚狀體產生。培養8 d后觀察花藥染菌率和死亡率，并將未染菌的花藥重新接種至上述培養基中繼續培養；培養30 d后，觀察愈傷組織、胚狀體誘導情況。篩選合適的抑菌劑及其適宜濃度。

1.2.2 花藥培養技術在不同辣椒品種中的應用

取不同基因型辣椒品種（23個）花蕾，并采用優化后的滅菌方式進行滅菌，再將其接種至添加最佳抑菌劑濃度的培養基中，培養30 d后，觀察花藥褐化及愈傷組織、胚狀體誘導情況。篩選出高再生頻率的辣椒品種。

1.3 數據處理

統計指標及計算公式為：花藥染菌率=染菌的花藥數目/接種的花藥數目×100%；花藥褐化率=褐化的花藥數目/接種的花藥數目×100%；死亡率=死亡的花藥數目/接種的花藥數目×100%；愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的花藥數目/接種的花藥數目×100%；胚狀體誘導率=產生胚狀體的花藥數目/接種的花藥數目×100%。

所有試驗處理重復3次，結果取其平均值。數據采用Excel軟件做圖，SPSS16.0軟件分析顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 辣椒花藥培養方法探析

2.1.1 兩種花蕾滅菌方式比較

由表2可知，對剝去3/4花萼的花蕾滅菌時更易殺死花蕾表面細菌和內生菌。接種14 d后發現，與不剝去花萼相比，剝去3/4花萼處理中花藥染菌率顯著降低，降幅為66.48%；花藥褐化率和花藥死亡率增加，但差異不顯著。由此可知，采用剝去3/4花萼的花蕾進行滅菌是合適的處理方式。

表1 抑菌劑種類及濃度處理mg/L

表2 花蕾滅菌處理對博辣紅牛花藥染菌率、褐化率及死亡率的影響%

2.1.2 兩種花藥接種方式比較

由表3可知，與鑷子夾取花藥相比，徒手擠壓對花藥傷害小。接種14 d后觀察，徒手擠壓花藥處理，花藥死亡率和愈傷組織誘導率極顯著低于鑷子夾取處理，其降幅分別達80.36%、80.04%，說明鑷子夾取花藥易夾死或夾傷花藥，導致花藥產生愈傷組織或死亡，而徒手擠壓花藥則可降低對花藥的傷害；褐化率降低，但與鑷子夾取處理差異不顯著；花蕾接種速度為鑷子夾取處理的2.18倍，說明徒手擠壓花藥省時、省工，可有效降低人工成本。

2.1.3 抑菌劑種類和濃度對花藥培養的影響

由表4可知，氨芐青霉素和兩性霉素B均可顯著降低花藥染菌率。2種抑菌劑合用比單獨使用一種抑菌劑效果更佳；高濃度抑菌劑雖然可以有效降低花藥染菌率，但也同時顯著提高了花藥死亡率、愈傷組織誘導率，抑制了胚狀體的誘導。往培養基中同時添加25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B，培養8 d后觀察到花藥染菌率為1.42%，死亡率為3.89%；培養30 d后，愈傷組織誘導率為13.51%，胚狀體誘導率為3.87%，由此說明，25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜于辣椒花藥培養。

2.2 花藥培養技術在不同基因型辣椒品種中的應用效果

由圖1可知，花藥培養時，花藥受損易產生愈傷組織（圖1A），胚狀體誘導受抑制。觀察到的胚狀體包括子葉形胚和畸形胚（球形胚、含根毛的胚）2種類型。子葉形胚（圖1G）可直接分化成苗，而球形胚、畸形胚狀體繼續培養雖可以生根，但因缺乏生長點而無法成苗（圖1B、C、D、 E、F）。

表3 兩種接種方式對博辣紅牛花藥培養及花蕾接種速度的影響

表4 氨芐青霉素和兩性霉素B處理對博辣紅牛花藥培養的影響%

圖1 花藥培養胚狀體情況

表4 不同基因型辣椒品種花藥胚狀體和單倍體植株誘導情況%

由表4可知，基因型不同，花藥胚誘導率均存在差異。23個基因型中，子葉形胚狀體誘導率在0.00%～6.71%，畸形胚狀體為0.00%～2.76%。11個辣椒品種能夠同時產生子葉形胚狀體和畸形胚狀體，5個辣椒品種僅能產生畸形胚。其中博辣紅牛、H15、辣八螺絲王的花藥的子葉形胚狀體誘導率大于5%，滿足種質創新條件。

3 結論與討論

目前，大多辣椒花藥培養文獻報道均采用花蕾直接滅菌，由于花萼與花瓣間隙中的細菌難以徹底殺死，接種后花藥染菌率仍然居高不下。本試驗剝去花蕾3/4的萼片再進行滅菌，花藥染菌率降低至5%以下，說明該方法更易殺死花蕾表面細菌和內生菌，具有可行性。

常規的花藥培養基需要高壓滅菌，接種需要在超凈工作臺中用鑷子夾取花藥轉至培養基表面。該方法需要特定的試驗環境，且由于辣椒花藥小，接種花藥費時費工，難以進行規模化生產。其他植物進行組織培養時，研究者們提出了一種新的組織培養方法，即通過往培養基中添加抑菌劑，使植物組織培養脫離嚴格無菌的操作環境進行組織培養的一種方法，稱之為開放式組織培養[10-11]。目前，已廣泛應用于葡萄、香蕉、煙草等植物的組織培養中[12-14]。在開放組織培養過程中，添加了抑菌劑的培養基不需要在高溫高壓下進行滅菌，接種外植體也不需要在超潔凈的工作臺上進行；因此，該方法從根本上簡化了組織培養環節，降低了成本。

本研究中，選擇氨芐青霉素和兩性霉素B作為抑菌劑，用于在開放條件下博辣紅牛花藥培養。結果顯示，25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜用于辣椒花藥培養，花藥染菌率1.42%，死亡率為3.89%，愈傷組織誘導率為13.51%，胚狀體誘導率為3.87%，由此說明，25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜于用做開放式培養抑菌劑。此外，還改進了花藥接種方式，試驗結果表明：徒手擠壓花藥可降低對花藥的傷害，花藥接種速度與傳統方法相比可提高2.18倍，說明徒手擠壓花藥省時、省工，可有效降低人工成本。

作物花藥胚狀體誘導率與基因型密切相關。辣椒花藥培養受基因型、生長環境、植株狀態、培養基成分等多種因素的影響，基因型是影響辣椒花藥培養的重要因素之一[15]。本研究也表明不同基因型間花藥胚狀體誘導率存在差異，且從23個基因型品種中篩選到了3個高誘導頻率的辣椒品種，其胚狀體誘導率大于5%，可滿足種質創新條件。