人參煎劑對實驗紅鯽經137Cs輻射后肝腎組織HSP70表達量的影響*

李登科 彭贊平 陳科潔 吳端生 王余德

(1. 南華大學衡陽醫學院，衡陽 421001)(2. 岳陽市婦幼保健院，岳陽 414000)(3. 南華大學實驗動物學部，衡陽 421001) (4.湖南師范大學生命科學學院省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，長沙 410006)

隨著人類社會的發展，醫學、農業和工業中的電離輻射日趨增加，人類受到來自各方面輻射的威脅，故加強輻射生物效應研究很有意義。輻射可直接誘導機體自由基ROS的產生，自由基與DNA相互作用可誘導遺傳損傷[1]，導致基因突變、致癌和細胞凋亡[2]，影響蛋白質的表達，還可通過增加自由基的形成來啟動細胞內一系列氧化應激反應[3]。而肝臟、腎臟作為機體高度代謝活躍的器官，易受到氧化應激損傷，導致其結構和功能受到損害。本實驗室培育了標準化的實驗紅鯽[4]，在探討實驗紅鯽應用過程中，嘗試過實驗紅鯽應用于輻射生物效應的研究[5]。本文旨在報道137Cs輻照對實驗紅鯽肝、腎組織HSP70表達的影響，并探討人參煎劑對實驗紅鯽的輻射防護效應。

1 材料與方法

1.1 實驗魚及馴化

實驗紅鯽C1HD系，80尾，雌雄各半，體長為(11.5±0.9)cm，體質量(64.2±1.6)g，均由南華大學實驗動物學部提供。實驗紅鯽馴養于水族箱中，采用曝氯2 d的自來水，馴養7 d后用于實驗，水溫維持(18±2)℃，pH值(6.48±0.3)，溶氧量(6.28±0.5)mg/L。實驗期間，按常規投喂維持飼料，并用增氧泵持續充氧。

1.2 主要試劑及儀器

藥用人參切片購于長白林寶公司；BCA蛋白含量測定試劑盒及?-actin一抗購于碧云天公司；HSP70一抗購于Abcam公司；HSP70二抗及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于康為生物試劑公司。

HXFS-IA生物輻照儀：中國核工業集團；高速冷凍離心機：THERMO公司；凝膠成像系統：Tanon公司；半干/濕轉膜儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1人參煎劑制備：稱取500 g人參切片，將人參加雙蒸水浸泡30 min后放于熬制罐中，加入蒸餾水，文火熬制三次，每次熬制1 h，收集三次人參煎劑濃縮至500 mL，制成1 g/mL人參煎劑后用過濾除菌法滅菌，4 ℃保存待用。人參煎劑給藥方式為：加濃縮液至養殖水中稀釋藥液濃度至0.1 g/L后，投放實驗魚浸浴其中。

1.3.2實驗分組及處理：實驗分組及處理，如表1，分別解剖實驗紅鯽3尾，提取肝臟、腎臟用于HSP70表達量的測定。

表1 實驗分組及實驗處理Table 1 Group of Experiments and experimental treatment

輻照處理組均用HXFS-IA生物輻照儀以不同劑量的137Cs一次性輻照。即：將實驗紅鯽個體放置在HXFS-IA生物輻照儀輻射室內自動旋轉的金屬載物筒內，魚體距離輻射源頭約150 mm，通過調節輻照時間，輻照儀則自動設定輻射劑量率。

1.3.3HSP70蛋白表達量的測定：肝臟、腎臟組織經勻漿機研磨后，裂解離心提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測總蛋白含量。用10%分離膠進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠80 V，30 min；分離膠110 V，80 min)，濕轉法進行蛋白轉膜(300 mA，2h)，用5%脫脂奶粉常溫下封閉2 h；加入一抗HSP70(1∶1 000稀釋)以及β-actin (1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，二抗(1∶3 000稀釋)室溫下孵育1 h，經洗滌、顯影拍照后用軟件ImageJ分析目的條帶及內參β-actin條帶的灰度值。

1.4 統計方法

采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行單因素ANOVA分析，以P<0.05認為差異有顯著性，并用GraphPad Prism5軟件制圖。

2 結果

2.1 實驗紅鯽肝臟HSP70蛋白表達量變化

實驗紅鯽經137Cs輻照及人參煎劑給藥處理后，分別于第14、28天取樣檢測實驗紅鯽肝臟中HSP70的表達量，結果如圖1和圖2所示。由圖可知，1組和2組的Hsp70的蛋白表達量，無論第14天還是第28天，差異較小，提示單一的人參煎劑處理對肝臟HSP70表達無明顯影響。經分析1組、3組和6組的Hsp70表達量變化，發現137Cs輻射可引起HSP70表達量的升高，且隨輻射劑量和輻射時間的增加而增加，差異有統計學意義(P<0.05)。分別比較分析3組、4組、5組和6組、7組、8組，發現4組、5組的HSP70表達量比3組有較大幅度的下降，7組、8組的HSP70表達量比6組有較大幅度的下降，差異均顯著(P<0.05)，表明將人參煎劑用于預防或治療均可抑制輻射所致實驗紅鯽肝臟HSP70表達的上升；分別比較4組、5組和7組、8組，發現人參煎劑用做預防或治療處理時，兩者之間的HSP70表達量均無明顯差異。

圖1 第14天實驗紅鯽肝臟HSP70表達量注：與4.1Gy輻照組比較，*P<0.05；與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.1 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp liver at day 14Note: Compared with 4.1Gy group, *P<0.05; Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

圖2 第28天實驗紅鯽肝臟HSP70表達量注：與4.1Gy輻照組比較，*P<0.05；與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.2 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp liver at day 28Note: Compared with 4.1Gy group, *P<0.05; Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

2.2 實驗紅鯽腎臟HSP70蛋白表達量變化

不同實驗組的實驗紅鯽腎臟組織HSP70表達量，如圖3和圖4所示。由圖3和圖4經統計分析可知，在137Cs 輻照后第14天，實驗紅鯽腎臟HSP70的表達量，輻照組的均顯著高于對照組、預防組和治療組的，差異有統計學意義(P<0.05)；在經137Cs輻照后第28天，4.1Gy輻照組的實驗紅鯽腎臟HSP70表達量顯著高于對照組的(P<0.05)，但與預防組和治療組的相比，差異均不明顯(P>0.05)；8.2Gy輻照組的實驗紅鯽腎臟HSP70表達量也顯著高于對照組的和治療組的(P<0.05)，但與預防組的相比，無明顯差異(P>0.05)。分別比較3組、4組和7組、8組，同樣發現人參煎劑做預防或治療處理，兩者之間的HSP70表達量均無明顯差異。

綜合以上結果表明，137Cs輻照均能使實驗紅鯽肝臟和腎臟HSP70蛋白表達量升高，人參煎劑對正常實驗紅鯽肝臟和腎臟HSP70表達的影響不明顯，但人參煎劑能夠預防或抑制因137Cs輻照而引起的實驗紅鯽肝臟和腎臟HSP70蛋白表達量的升高。

圖3 第14天實驗紅鯽腎臟HSP70表達量注：與4.1Gy輻照組比較，*P<0.05；與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.3 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp kidney at day 14Note: Compared with 4.1Gy group, *P<0.05; Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

圖4 第28天實驗紅鯽腎臟HSP70表達量注：與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.4 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp kidney at day 28Note: Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

3 討論

3.1 HSP70及功能

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)屬于熱應激反應性蛋白，是一種保護性蛋白。它在細胞中執行最基本的生理功能，以維持細胞的生存和功能，在應激的不利條件下，提高細胞的抵抗力，起到應激保護作用[6]。HSP具有分子伴侶的作用，保護蛋白質免受損害或重新折疊有缺陷的多肽，以試圖恢復其天然構象[7]。由于HSP家族不同成員的合成會響應各類不同應激源而表達，包括極端生理、環境和病理的損害，故有人提出熱休克蛋白可作為環境監測的一般生物標志物[8]。在水產養殖中，魚類經常遭受高溫，水質差，細菌和病毒侵襲，造成機體與環境之間的平衡失調，引起魚類發生應激反應[9]。HSP70作為HSP家族中的成員之一，能在應激情況下迅速合成，并對應激產生保護耐受作用，在響應熱休克，免疫保護，寄生蟲感染等應激條件中發揮重要作用[10-11]。

3.2 137Cs輻射與HSP70表達

研究資料表明，生物暴露于輻射環境中可引起體內產生大量的自由基ROS(O2-、H2O2及HO2·、·OH等)，而使細胞或組織產生氧化應激反應，進而引發HSP70的大量合成而使細胞減弱氧化應激傷害[12]。本實驗結果也發現，實驗紅鯽經137Cs輻照后肝臟及腎臟中HSP70表達水平均有顯著上升，且存在一定的量效關系。HSP70可通過多種途徑減少輻射對組織和器官的損傷，可直接抑制ROS產生依賴的NADPH氧化酶的活性，并能控制蛋白復合物的正確折疊、轉運、組裝和拆卸，維持細胞的正常生理功能[13-14]。有研究表明，通過用紫草紅處理人角質形成細胞HaCaT細胞，使HSP70過表達，發現HSP70不僅能干擾半胱天冬酶活化以阻斷細胞凋亡，還可通過抑制NF-kB信號傳導減少促炎細胞因子(如IL-1b)的產生，起到抗炎作用[15]。此外，HSP70的輻射防護潛力還與其免疫調節能力有關[16]。這些都說明HSP70在調節細胞輻射損傷的修復過程中起關鍵作用。

3.3 人參抗輻射氧化損傷

人參對輻射所致機體損傷的保護作用已有文獻報道[17]。本實驗結果也表明，實驗紅鯽在經4.1 Gy和8.2 Gy輻照后，HSP70的表達量增加，說明HSP70具有抗氧化應激的作用，這一實驗結果與本課題組前期實驗結果相吻合[5]。本實驗結果也表明，經人參煎劑處理(預防或治療)的實驗紅鯽肝、腎HSP70的表達量均顯著下降，提示人參煎劑具有抗輻射氧化損傷的作用。已有的研究表明, 人參煎劑抗輻射氧化損傷的機理可能與人參皂甙的藥效有關。人參皂甙是人參發揮藥效的主要活性物質，可通過清除機體產生的多余自由基發揮其抗氧化能力，具有抗炎，輻射防護，抗應激，免疫調節，抗疲勞和抗腫瘤等特性[18-19]。此外，人參可通過調節細胞凋亡信號通路來發揮對輻射致肝損傷的保護作用[20]。本實驗中，在8.2Gy137Cs輻照實驗紅鯽后第28天時輻照組腎臟HSP70表達量與預防組、治療組的差異不明顯，可能是人參藥效減弱所致；而肝臟HSP70表達量均高于預防組和治療組的HSP70表達量，可能是由于人參皂甙在實驗紅鯽體內的肝腸循環使肝臟仍有一定的藥物濃度。

3.4 實驗紅鯽應用于輻射生物效應研究

實驗紅鯽C1HD系是南華大學吳端生教授研究團隊近年來培育的中國本土的實驗魚類近交系，具有應用于毒理學研究和環境安全性評價的許多優點[21]，在輻射生物效應方面曾做過實驗，結果表明，實驗紅鯽經137Cs輻照1.92Gy劑量即可出現血液生理生化指標的改變，相當于人類的0.5Gy輻照劑量，表現為肝臟、腎臟、腦及心臟等不同程度的損傷，且存在著一定的“劑量-時間-效應”關系[5]。2016年12月，湖南省質量技術監督局發布了《實驗紅鯽C1HD系遺傳質量控制》地方標準[4]。通過本次實驗，作者認為實驗紅鯽作為輻射生物效應研究的模式動物是可行的。