液質聯用法測定飼料原料乳清粉中的喹烯酮含量

■金曉峰 焦仁剛 趙 貴 黃 鑫 欒慶祥 章厲劼 孫播東

（貴州省獸藥飼料監察所，貴州貴陽 550003）

近年來，隨著乳制品工業的發展以及我國養殖水平的提高，乳清粉已經成為幼畜尤其是乳豬飼料中不可缺少的原料之一[1]，具有提高幼齡仔豬的采食量和生長速度[2]、降低仔豬血清尿素氮，增強蛋白質沉積能力[3]、調節免疫力[4]等作用，廣泛應用于飼料行業。

喹烯酮(Quinocetone)是中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制的畜禽抗菌、止瀉、促生長新藥，屬喹噁啉類藥物，為淡黃色或黃綠色粉末，不溶于水，略溶于部分有機溶劑，對光敏感，較易發生光化學反應[5]，化學結構式見圖1。

圖1 喹烯酮化學結構式

喹烯酮的毒性小，作為飼料添加劑，具有提高動物生產性能和飼料轉化率，降低腹瀉率和死亡率等功能[6]，被應用于藥物飼料添加劑。但2009年有研究顯示，喹烯酮具有潛在的遺傳毒性，能造成遺傳物質的損傷[7]。因此，有必要控制喹烯酮的使用，并建立飼料及飼料原料中喹烯酮含量的方法，以監控飼料產品質量安全情況。

目前，我國已建立了飼料中喹烯酮的檢測方法[8]，但通過試驗驗證，不適用于乳清粉等高蛋白含量的飼料原料，無法檢出其中喹烯酮含量。其他已報道的喹烯酮含量測定方法還有液相色譜法[9-11]，經試驗驗證，也無法檢出乳清粉等高蛋白含量的飼料原料中喹烯酮含量。鑒于液相色譜串聯質譜技術擁有更高的靈敏度和更好的準確性，本文研究并建立了一種采用液質聯用法測定飼料原料乳清粉中喹烯酮含量的方法。

1 試驗部分

1.1 主要儀器

Waters XEVO TQ-xs 高效液相色譜串聯質譜聯用儀（美國沃特世公司）；Milli-Q Direct-Q10 超純水機（美國密理博公司）；SIGMA 3K15 高速冷凍離心機（德國西格瑪公司）；METTIJER AB104-S電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Reacti-Therm Ⅲ氮吹儀（美國賽默飛公司）；IKA MINISHARKER 渦旋振蕩器（德國伊卡公司）；SG5200HPT超聲波清洗機（上海冠特儀器有限公司）。

1.2 主要試劑

喹烯酮對照品（中國獸醫藥品監察所）；Waters PRiME HLB 固相萃取柱（規格為60 mg/3 ml，美國沃特世公司）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，德國默克公司）；二甲亞砜（分析純，國藥集團化學試劑公司）；試驗用水均為Milli-Q Direct-Q10超純水。

2 方法

2.1 標準溶液的配制

精密稱取適量喹烯酮對照品于棕色容量瓶中，少量二甲亞砜溶解后，用甲醇稀釋得到含喹烯酮濃度為1 000 μg/ml 的標準儲備液。取適量喹烯酮儲備液，用甲醇稀釋得到含喹烯酮10 μg/ml 的標準中間液。為消除基質效應，本方法采用基質加標制備標準曲線，分別精密量取適量的喹烯酮標準中間液，加入到凈化后的空白試樣中，50 ℃下氮氣吹干，1 ml甲醇-1%甲酸水溶液（10∶90）溶解，繪制濃度為20、50、100、200、500、1 000 ng/ml的標準工作曲線。

2.2 飼料原料乳清粉中喹烯酮的提取

稱取飼料原料乳清粉(1.00±0.05) g 于50 ml 離心管中，加入80%乙腈（含甲酸0.2%）10 ml，渦旋提取1 min，超聲提取15 min，于10 000 r/min 轉速下離心5 min，收集上層提取液于另一離心管中，備用。

2.3 飼料原料乳清粉中喹烯酮的凈化

將PRiME HLB 固相萃取柱安裝到真空萃取裝置上，取1 ml上清液過柱，收集全部濾液，備用。

2.4 測定方法

將前處理后的樣品液于50 ℃下氮氣流吹干，1 ml甲醇-1%甲酸水溶液（10∶90）溶解，過0.22 μm 濾膜后供高效液相色譜串聯質譜聯用儀測定。

已有的報道中測定方法多為液相法或液質法，液相法多采用高效系統，質譜系統多采用電噴霧離子源（+）的方式，本研究參考了相關文獻[8，12]，對液質聯用儀的儀器條件進行了優化。

2.4.1 色譜條件

色譜柱（型號為Waters BEH Shield RP18 ，規格為1.7 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫30 ℃，進樣量為1 μl，流速為0.3 ml/min，流動相采用甲醇+0.2%甲酸水溶液（梯度方式），梯度比例見表1。

表1 高效液相色譜流動相梯度條件

2.4.2 質譜條件

離子源為電噴霧ESI+，源溫為120 ℃，霧化溫度為400 ℃，霧化氣流流速為500 L/h，錐孔氣流流速為60 L/h。

2.4.3 喹烯酮特征離子（見表2）

表2 喹烯酮特征離子

3 結果

3.1 試驗譜圖

經上述方法測試，標準溶液、空白試樣及陽性添加試樣經液相色譜串聯質譜聯用儀分析得到的圖譜見圖2～圖4。

3.2 標準曲線的繪制

圖2 標準溶液特征離子圖譜

圖3 空白試樣特征離子圖譜

喹烯酮對照品工作液按峰面積以外標法進行回歸計算，繪制得到的標準曲線見圖5，在線性范圍為20～1 000 ng/ml下相關系數R2為0.999 1。

3.3 提取劑的選擇

現有標準和文獻報道中，喹烯酮通常使用40%乙腈[8]、100%乙腈[9]、60%乙腈[10]、甲醇-乙腈溶液（1∶1）[12]、0.5%磷酸緩沖液(pH=3.0)[13]等作為提取劑。飼料原料乳清粉蛋白質含量極高，經試驗驗證以上提取劑的提取效果均不理想，本研究比較了上述提取劑和甲酸酸化的80%乙腈的效果（結果見表3），最終選擇甲酸酸化的80%乙腈為本方法提取液。

3.4 凈化方式的選擇(見表4)

圖4 陽性添加樣品特征離子圖譜

現有標準和文獻報道中，喹烯酮凈化方式主要有HLB 固相萃取[8，11]、中性氧化鋁固相萃取[12]，也有不經過凈化，直接上機測定含量的方式[9，13]。省去凈化環節可減少前處理操作，但樣品基質較復雜，不利于儀器的長期使用，同時帶來的基質效應也非常強，本研究選擇了新一代PRiME HLB 固相萃取柱，樣品提取液不經過淋洗和洗脫過程，減少前處理操作的同時，也起到了良好的凈化作用。

3.5 靈敏度考察

向空白試樣中添加適量喹烯酮，經上述方法測試液質聯用試驗譜圖，觀察特征離子質量色譜峰信噪比（S/N）和對應藥物的濃度，S/N＞3 者為方法檢測限，S/N＞10 者為方法定量限。當樣品中喹烯酮含量為5 μg/kg 時，液質譜圖中喹烯酮峰S/N＞3，即檢測限為10 μg/kg；當樣品喹烯酮含量為10 μg/kg時，液質譜圖中S/N＞10，即定量限為10 μg/kg。說明當飼料原料乳清粉中喹烯酮含量高于0.5 μg/kg時即可檢出，當含量高于1.0 μg/kg時即可準確定量。

圖5 喹烯酮標準曲線

3.6 準確度和精密度考察

表3 提取劑回收試驗結果

表4 不同凈化方式回收試驗結果

向空白試樣中添加適量喹烯酮，制備得到喹烯酮含量分別為20、50、100、500 μg/kg 的陽性添加試樣，每個濃度6 份平行試樣，按上述最佳方法進行提取、凈化、濃縮、測定，以實測含量與理論含量的百分比計算回收率，考察方法的準確度；同時計算相對標準偏差（RSD），以批內和批間試驗結果的RSD考察方法的精密度。試驗結果如表5。

由表5 可知，飼料原料乳清粉中各濃度喹烯酮含量測定回收率范圍在79.9%～90.8%之間，準確度較高。

表5 飼料原料乳清粉樣品準確度及精密度試驗結果（n=6）

從飼料原料乳清粉中各濃度喹烯酮含量測定結果分析試驗精密度，批內變異系數RSD 為1.71%～4.48%，批間變異系數RSD為5.24%，精密度較高。

4 討論

4.1 提取劑的選擇

本文研究了甲酸酸化的80%乙腈、40%乙腈、60%乙腈、甲醇-乙腈溶液（1∶1）、0.5%磷酸緩沖液、100%乙腈等提取劑的提取效果。磷酸緩沖液應不具備揮發性，不適用于液質聯用法檢測，未進行測試，40%乙腈、60%乙腈加入到飼料原料乳清粉中，因樣品溶解到提取液中，改變了極性，形成明顯的分層現象，經試驗測試，上下兩層均有喹烯酮，但濃度比例沒有規律，未采用該兩種提取液；其余三種提取液經試驗比較，甲酸酸化的80%乙腈提取效率較好，最終確定為提取劑。

4.2 選擇凈化方式

比較了HLB固相萃取和PRiME HLB固相萃取柱的凈化效果，均達到預期要求，因PRiME HLB方法簡化了前處理過程，凈化時間由40 min縮短至5 min，故本文選擇了PRiME HLB 的凈化方式，取得的效果較為滿意。

4.3 避光操作

喹烯酮是喹噁啉類藥物，見光易分解的，試驗過程應注意避光操作，對照溶液應存放在棕色溶劑瓶中，試樣上機液也應盛放于棕色樣品瓶中。

5 結論

本文研究了飼料原料乳清粉中喹烯酮藥物提取方法、凈化方法對試驗結果的影響，建立了采用甲酸酸化的80%乙腈提取飼料原料乳清粉中的喹烯酮，PRiME HLB 固相萃取凈化，高效液相色譜串聯質譜聯用儀測定喹烯酮的含量的方法。經試驗，確定了方法的線性范圍、靈敏度，同時驗證了試驗方法的準確度、精密度，填補了飼料原料乳清粉中喹烯酮含量檢測的技術空白。