SIAH1核異位表達抑制乳腺癌細胞凋亡的作用機制

蔡存偉，溫媛媛，李曉燕，張麗娜

（1. 中國醫科大學腫瘤醫院，遼寧省腫瘤醫院病理科，沈陽 110042； 2. 浙江省舟山醫院病理診斷中心，浙江 舟山 316021）

目前，乳腺癌發病率已躍居我國女性惡性腫瘤首位［1］。乳腺癌發病受多種因素 （遺傳和環境因素等） 影響。乳腺癌細胞具有異常增殖、分化程度低、侵襲能力強、轉移發生早和細胞凋亡減少等特征，其中凋亡機制異常認為與乳腺癌的發生密切相關［2］。SIAH1 （seven in absentia homologue-1） 含有環指結構，具有E3泛素連接酶活性，參與泛素化和蛋白酶體介導的特定蛋白質降解。傳統觀點認為SIAH1可介導包括自身在內的多種目標蛋白的泛素-蛋白酶體降解過程［3］。近年來研究［4-10］發現SIAH1亦與腫瘤細胞凋亡密切相關，但具體作用及機制尚不清楚。

S-亞硝基谷胱甘肽 （S-nitrosoglutathione，GSNO）是機體內源性一氧化氮供體，高濃度GSNO會對機體產生毒性。GSNO使帶有游離巰基的蛋白發生S-亞硝基化修飾。研究［11］發現GSNO可以使細胞中甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 發生S-亞硝基化，S-亞硝基化的GAPDH可以和SIAH1結合，使SIAH1入核選擇性地降解目標蛋白。

前期研究［12］發現單純性增生乳腺組織發展為浸潤性癌的過程中，SIAH1蛋白在細胞質中表達逐漸降低，而在細胞核中表達逐漸升高，出現明顯的核內蓄積趨勢。同時前期研究［13］表明細胞質內SIAH1可通過激活MAPK/JNK/c-jun通路促進Bim mRNA和蛋白表達，進而誘導乳腺癌細胞凋亡。本研究探討乳腺癌中SIAH1蛋白細胞核-細胞質穿梭現象的原因，進一步觀察SIAH1核異位后對乳腺癌細胞生物學行為的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

收集浙江省舟山醫院病理科2014年至2015年40例原發性乳腺浸潤性導管癌手術切除石蠟標本，患者年齡為33～76歲 （中位年齡49歲），所有患者術前均未接受放化療，所有病理資料均由2名高級職稱病理醫師聯合診斷。本研究及所有標本使用經舟山醫院倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。

主要試劑包括S-P免疫組織化學檢測試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒 （DAB-0031） （中國福州邁新生物技術公司）；鼠抗人SIAH1抗體 （美國Santa Cruz公司），兔抗人Bim抗體 （美國Santa Cruz公司），β-actin抗體 （北京中杉金橋生物技術有限公司）；SIAH1 siRNA （美國Santa Cruz公司）；DMEM培養液、胎牛血清 （美國GIBCO公司）； Lipofectamine 2000、核蛋白提取試劑盒 （美國Invitrogen公司） 。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色及結果判定：標本經4%中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μ m切片，按照S-P免疫組織化學檢測試劑盒說明書步驟進行SIAH1 （1∶200） 免疫組織化學染色。SIAH1核異位表達判定標準：以細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性顯色。

1.2.2 細胞培養及SIAH1核異位表達乳腺癌細胞模型的構建：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2環境下培養乳腺癌細胞系MCF-7。隨后在MCF-7細胞中加入100 mmol/L GSNO培養24 h后收集細胞。

1.2.3 RNA干擾：干擾片段為 SIAH1 siRNA、control siRNA和 E2F1 siRNA，按照脂質體Lipofectamine 2000試劑說明書進行操作、轉染，培養48 h后收集細胞。

1.2.4 Western blotting檢測：按照相應蛋白提取試劑盒說明書分別提取核蛋白及總蛋白，測定蛋白濃度，樣品和上樣緩沖液以4∶1混合，SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗山羊抗人SIAH1 （1∶400），兔抗人Bim （1∶400），抗β-actin（1∶200） 和兔抗人LaminB1 （1∶400），4 ℃ 孵育過夜；Ⅱ抗 （酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，上海基因科技股份有限公司） 孵育2 h，TBST洗脫3次，發光顯影；應用Image J軟件進行蛋白條帶灰度分析。實驗至少重復3次，計算平均值。

1.2.5 免疫熒光及共聚焦實驗：乳腺癌細胞系MCF-7細胞中加入100 mmol/L GSNO培養24 h后，將細胞接種到預先放置處理過蓋玻片的培養皿中，細胞長成單層后取出蓋玻片，PBS洗2次；甲醇固定20 min，PBS洗3次，每次5 min；1%Triton 通透30 min，PBS洗3次，每次5 min；封閉30 min；一抗室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；50 μ g/mL FITC室溫避光孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；蒸餾水漂洗1次，DAPI（1∶200） 染色細胞核；滴加封片劑封片，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡：收集細胞，加入300 μ L 1×binding buffer 懸浮細胞，加入Annexin V-FITC （5 μ L） 混勻后進行Annexin V-FITC標記，加入PI （5 μ L） 染色，最后進行流式細胞儀分析。

1.2.7 GSNO合成：取4 mL GSH，加 2 mL HCl酸化，加入4 mL NaNO2，混合冰浴反應20 min，加入40%NaOH調整pH至7.0左右，避光保存。產物稀釋200倍，PBS為陰性對照，酶標儀測定334 nm處吸光度。計算GSNO濃度，利用PBS調整終濃度為100 mmol/L。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗，并計算Spearman等級相關系數，計量資料比較采用t檢驗或方差分析。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌中存在SIAH1核異位表達蓄積現象

前期研究［12］發現，SIAH1在正常乳腺組織中細胞質高表達，而細胞核陰性表達。在乳腺癌癌變過程中細胞質內SIAH1蛋白表達逐漸下調，且與乳腺臨床病理因素 （臨床分期、分化） 顯著相關。本研究結果顯示，部分患者乳腺癌組織中 （12/40） 乳腺癌細胞核內檢測出SIAH1陽性信號，SIAH1核表達在乳腺癌組織中高于對應的癌旁正常組織 （圖1） 。

2.2 GSNO誘導SIAH1核異位表達的乳腺癌細胞系構建

圖1 SIAH1在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達 ×200Fig.1 Expression of SIAH1 in normal breast tissue and breast cancer tissue ×200

為進一步研究SIAH1核異位表達對細胞功能的影響，本研究構建了GSNO誘導的SIAH1核異位表達的乳腺癌細胞系模型。激光共聚焦方法檢測結果顯示，乳腺癌MCF-7細胞中SIAH1主要在細胞質內低表達；給予100 mmol/L GSNO刺激后SIAH1在細胞核內表達增加 （圖2） 。Western blotting檢測結果表明，與對照組 （0.31±0.01） 比較，加入50 mmol/L和100 mmol/L GSNO刺激后，SIAH1核蛋白表達 （分別為1.21±0.20，1.85±0.35） 明顯增加 （均P < 0.05） 。

2.3 SIAH1核異位表達抑制細胞凋亡

圖2 MCF-7乳腺癌細胞系SIAH1的表達及定位 ×200Fig.2 Expression and localization of SIAH1 in MCF-7 the breast cancer cell line ×200

流式細胞儀檢測乳腺癌細胞凋亡結果顯示，與對照組 （11.02%±1.310%） 比較，加入100 mmol/L GSNO的實驗組可明顯抑制乳腺癌細胞凋亡 （24 h：2.02%±0.310%；48 h：1.06%±0.091%），差異均有統計學意義 （F分別為110.317、130.113，P分別為0.038、0.041），見圖3。

在乳腺癌MCF-7細胞系中應用siRNA片段干擾SIAH1的表達，與對照組比較，SIAH1siRNA組SIAH1的核蛋白表達缺失，見圖4 。在MCF-7-SIAH1SiRNA細胞中應用100 mmol/L GSNO處理24 h及48 h，流式細胞儀檢測凋亡率結果顯示，GSNO處理組在24 h及48 h后細胞凋亡率分別為0.83%±0.338%、0.72%±0.653%，與對照組 （1.05%±0.910%） 比較無統計學差異 （均P > 0.05），見圖5。

2.4 GSNO誘導SIAH1核轉位后E2F1/Bim的表達下降

圖3 流式細胞術檢測乳腺癌細胞的凋亡情況Fig.3 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

圖4 SIAH1核蛋白表達Fig.4 SIAH1 nuclear protein expression

Western blotting檢測結果表明，在MCF-7細胞中應用100 mmol/L GSNO刺激后，與對照組比較，SIAH1核蛋白表達增加，而E2F1和Bim蛋白表達均降低。在MCF-7細胞GSNO刺激的同時siRNA干擾E2F1結果發現，與對照組比較E2F1和Bim蛋白表達均下降 （圖6） 。

圖5 流式細胞術檢測乳腺癌細胞的凋亡情況Fig.5 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

圖6 SIAH1核蛋白表達Fig.6 SIAH1 nuclear protein expression

凋亡結果顯示，與未處理組比較 （10.32%±1.110%），MCF-7細胞GSNO刺激同時siRNA干擾E2F1組細胞凋亡率 （0.82%±0.021%） 明顯下降，差異有統計學意義 （F = 131.063，P < 0.05），見圖7。

3 討論

YOSHIBAYAS等［14］研究發現，SIAH1可通過依賴β-catenin降解和不依賴β-catenin降解2條途徑共同促進肝癌細胞凋亡。HE等［15］研究表明SIAH1可通過增強放射線敏感度促進乳腺癌細胞凋亡。而KUROKAWA等［16］發現SIAH1可以降低促凋亡蛋白HIPK2穩定性，提示其可能發揮抑制細胞凋亡作用。前期研究［12］提示SIAH1作為腫瘤抑制因子在乳腺癌癌變過程中發揮重要作用。

圖7 流式細胞術檢測乳腺癌細胞的凋亡情況Fig.7 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

本研究證實SIAH1在部分乳腺癌組織中存在核表達，提示乳腺癌中存在SIAH1核異位表達蓄積現象。有研究［11］發現SIAH1具有GSNO依賴的核異位表達現象。本研究顯示GSNO可以誘導乳腺癌細胞中SIAH1入核，抑制SIAH1表達后這種作用消失。流式細胞儀檢測結果表明GSNO可以抑制乳腺癌細胞凋亡，且這一過程與SIAH1核轉位有關。因此，進一步研究SIAH1核轉位抑制乳腺癌細胞凋亡的分子機制，對深入了解SIAH1生物學功能具有重要的意義。

研究［17］表明轉錄因子E2F1是細胞增殖和凋亡的關鍵調節因子，且在肺癌細胞系中E2F1可介導SIAH1的調控機制，本研究結果顯示給予乳腺癌細胞GSNO刺激后，細胞核SIAH1蛋白表達增加，而E2F1和Bim蛋白表達均降低，提示GNSO誘導SIAH1核異位后可能降低E2F1和Bim蛋白表達。為進一步研究E2F1/Bim在SIAH1核轉位中對細胞凋亡的影響，給予乳腺癌細胞GSNO刺激的同時siRNA干擾E2F1的表達，流式細胞儀檢測結果表明處理后的細胞早期凋亡率明顯下降，提示GNSO誘導SIAH核異位后抑制乳腺癌細胞凋亡可能是通過下調E2F1來調控的。

綜上所述，乳腺癌組織中可出現SIAH1核異位現象。在乳腺癌細胞系中，GNSO誘導SIAH1核異位后可能是通過下調E2F1的表達抑制乳腺癌細胞凋亡，提示SIAH1可能成為乳腺癌治療的潛在靶點。E2F1/Bim是如何在GSNO誘導的SIAH1核異位表達中發揮作用，具體機制有待于今后進一步探討。