白藜蘆醇對碘海醇所致糖尿病大鼠腎損傷的作用及其機制

龐天舒，王巖 ，左中夫，任克 ，劉學(xué)政

（1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬遼河油田總醫(yī)院疾病預(yù)防控制科，遼寧 盤錦 124010； 2. 錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；3. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，沈陽 110001）

對比劑腎病是因?qū)Ρ葎┒鴮?dǎo)致的急性腎功能衰竭，有研究［1-2］發(fā)現(xiàn)低滲透型對比劑碘海醇，因高含碘量在體內(nèi)以原形由腎小球濾過而不被腎小管吸收，脫水時該藥在腎內(nèi)濃度增高，可致腎損害而發(fā)生急性腎衰竭。糖尿病是對比劑腎病的危險因素之一，糖尿病患者發(fā)生對比劑腎病的概率高達50%［3］。沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白-1（silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1） 是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰酶，在細胞的分化、增殖、凋亡、衰老、抵抗炎癥、延長細胞存活時間等方面都發(fā)揮著重要的作用［4-9］。近年來發(fā)現(xiàn)，SIRT1唯一激動劑——白藜蘆醇 （resveratrol，Res） 可以抑制細胞凋亡，改善糖尿病腎病大鼠腎功能損傷［10］，但其具體機制有待證實。低氧誘導(dǎo)因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在嚴重缺氧條件下或缺氧的早期階段，HIF-1與P53相互作用，誘導(dǎo)凋亡，有研究［11］發(fā)現(xiàn)，SIRT1可以通過調(diào)控HIF-1的表達影響凋亡。本研究探討Res對碘海醇所致糖尿病大鼠腎損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級糖尿病大鼠45只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（京） 2012003］。采用隨機數(shù)字法分為3組：假手術(shù)組（Sham組，n = 15）、碘海醇組 （NL組，n = 15） 和Res組（n = 15）。

1.2 模型制備

采用文獻［12］對比劑腎損傷模型建立方法，Res組大鼠給予Res （100 mg/kg） 灌胃，NL組及Sham組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥5 d，第6天大鼠禁食水，第7天大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，剝離股靜脈，穿刺股靜脈，NL組及Rse組先后注射吲哚美辛 （10 mg/kg）、左旋硝基精氨酸甲酯 （10 mg/kg）、碘海醇 （3 g/kg），每次給藥間隔15 min，Sham組同時間注射等量生理鹽水，待大鼠平穩(wěn)后，逐層縫合。

1.3 樣品采集

模型建立48 h后過量麻醉處死大鼠，經(jīng)下腔靜脈取血 （5 mL），部分送檢驗科檢測血清肌酐 （serum creatinine，Scr） 和血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN），另一部分低溫冰箱保存用于ELISA檢測，然后于腹主動脈注入大量冷凍生理鹽水，直至流出清亮液體，剝離腎臟，于PBS緩沖液中剔除腎臟周圍脂肪及其他組織，一部分于甲醛中固定用于HE染色及TUNEL檢測，另一部分錫紙包裹于-80 ℃冰箱保存，用于Western blotting及qRT-PCR檢測。

1.4 HE染色

取多聚甲醛中固定的腎臟組織，流水沖洗1 h，濾紙浸干，分別置于70%、80%、90%、100%乙醇中，二甲苯中20 min，浸蠟中3 h，包埋機包埋，切片機切片，厚度4～6 μ m，將切片放入37 ℃烤箱中過夜，再分別2次放入二甲苯中進行脫蠟處理，完成脫蠟的切片放入濃度遞減的梯度乙醇中脫水，之后進行蘇木素染色5 min，酸化水反藍，伊紅染1 min，分別浸80%、90%、95%、100%乙醇1 min，二甲苯5 min，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 ELISA 檢測

為觀察Res對碘海醇導(dǎo)致的糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激及腎功能影響，采用ELISA試劑盒 （武漢USCN公司） 檢測大鼠總超氧化物歧化酶 （total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 和谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione，GPX） 的含量，具體操作步驟參照說明書進行，空白孔加樣品稀釋液 （100 μ L），余孔分別加標準品或待測樣品 （100 μ L），37 ℃孵育2 h；棄去液體，甩干，每個孔中加入Detection Ab工作液 （100 μ L），37 ℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，洗板 3次；每孔加HRP Conjugate工作液（ 100 μ L），37 ℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干；每孔加底物溶液（ 100 μ L），37 ℃避光孵育15 min左右；每孔加終止液（ 50 μ L）終止反應(yīng)，酶標儀在450 nm波長測量各孔光密度（ optical density，OD）。

1.6 TUNEL檢測

切片，常規(guī)脫蠟，水化，3%H2O2甲醇溶液，室溫下30 min，封閉過氧化物酶，洗滌；滴加蛋白酶K工作液，37 ℃孵育，恢復(fù)至室溫，洗滌； 0.1%TritonX-100，1%枸鹽酸鈉溶液，恢復(fù)室溫，洗滌；滴加反應(yīng)混合物，37 ℃孵育90 min，洗滌，正常山羊血清封閉，室溫20 min，棄去血清，滴轉(zhuǎn)化POD溶液，37 ℃孵育30 min，恢復(fù)室溫，洗滌。光鏡下陽性細胞核染色為棕黃色，水洗終止反應(yīng)。

1.7 Western blotting檢測

將腎臟組織加入RIPA細胞裂解緩沖液中電動勻漿器均漿、離心后聚氰基丙烯酸正丁酯 （bicinchoninic acid，BCA） 蛋白定量試劑盒 （南京凱基生物公司） 對蛋白進行定量后進行電泳，轉(zhuǎn)膜，過夜。加入SIRT1 （ab110304）、HIF-1 α （ab187524） 抗體，4 ℃孵育過夜，再將其與過氧化物酶標記的羊抗兔IgG室溫下反應(yīng)，室溫孵育2 h后將膜與增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL） 反應(yīng)后曝光顯色，結(jié)果使用Image Tools （Irbis Technologies） 進行吸光度分析，實驗結(jié)果以相應(yīng)蛋白條帶的OD比值來表示。

1.8 qRT-PCR檢測

將收集的組織充分研磨，加入Trizol （美國Invitrogen公司，15596026） 溶液中，按照Trizol試劑操作說明書分離提取組織和細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA后，按照qRT-PCR法檢測SIRT1、HIF-1 α反應(yīng)，參照試劑盒操作說明書配制，引物序列：SIRT1，上游引物，5’-CAGCATTGCCCAGAAGAA -3’；下 游 引 物 ，5’-CGTGGAGGACAGTGTAGGTG -3’。HIF-1α，上游引物，5’-TGCTGCTACTGCTCTG -3’；下游引物，5’-TGGAGTGAGGACGAAC-3’。β-actin，上游引物，5’-CATCTACGAGGGCTACGC -3’，下游引物，5’-TCTCCTTGATGTCCCGCA-3’。由上海生工生物公司進行合成。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次； 融解曲線分析95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和融解曲線。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟病理學(xué)結(jié)果

模型建立48 h后，HE染色觀察腎臟病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎小管上皮細胞排列規(guī)則，腎小管結(jié)構(gòu)正常；NL組大鼠腎小管空泡變性，細胞脫落至小管腔，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，提示碘海醇可以導(dǎo)致糖尿病大鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變，建模成功。Res組僅見少量腎小管細胞空泡變性，部分細胞脫落至小管腔，腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，提示Res可以改善碘海醇導(dǎo)致的糖尿病大鼠腎功能損傷，見圖1。

2.2 各組大鼠血清總Scr和BUN比較

圖1 各組大鼠腎臟病理學(xué)HE染色結(jié)果×200Fig.1 HE staining of renal tissue in each group ×200

進一步檢測大鼠血清總Scr和BUN情況，結(jié)果顯示，建模48 h后，與Sham組比較，NL組大鼠血清總Scr、BUN含量明顯升高 （P ＜ 0.05）；與NL組比較，Res組大鼠血清總Scr、BUN含量明顯降低 （均P ＜ 0.05），與病理學(xué)結(jié)果一致，提示碘海醇可以誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎功能損傷，Res可以改善碘海醇誘導(dǎo)的糖尿病腎損傷。見表1。

2.3 各組大鼠 T-SOD、MDA和GPX含量比較

表1 各組大鼠血清BUN和Scr含量比較Tab.1 Comparison of plasma BUN and Scr levels in each group

ELISA法檢測結(jié)果顯示，建模48 h后與Sham組比較，NL組大鼠血清中MDA含量顯著升高，而T-SOD和GPX顯著降低 （均P ＜ 0.05），提示碘海醇可以通過促進氧化應(yīng)激誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎損傷。與NL組比較，Res組大鼠血清中T-SOD和GPX含量顯著升高 （均P ＜ 0.05），MDA顯著降低 （P ＜ 0.05），提示Res可以通過抑制氧化應(yīng)激改善碘海醇誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎損傷，見表2。

2.4 TUNEL檢測結(jié)果比較

Res對碘海醇誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎損傷的影響通過TUNEL檢測顯示，與Sham組比較，NL組大鼠腎小管上皮細胞凋亡明顯。與NL組比較，Res組僅見少量腎小管上皮細胞凋亡。提示Res可以抑制腎小管上皮細胞凋亡，減輕腎功能損傷。 見圖2。

表2 各組大鼠血清中T-SOD、GPX和MDA含量比較Tab.2 Comparison of serum T-SOD，GPX，and MDA levels in each group

2.5 各組大鼠SIRT1、HIF-1 α蛋白表達比較

圖2 各組大鼠TUNEL結(jié)果 ×200Fig.2 TUNEL results of each group of rats ×200

為觀察Res對碘海醇誘導(dǎo)對比劑腎損傷大鼠SIRT1、HIF-1 α蛋白表達的影響，采用Western blotting檢測SIRT1、HIF-1 α蛋白表達，結(jié)果顯示，與Sham組比較，NL組大鼠HIF-1 α表達明顯是升高，而SIRT1表達明顯降低 （P ＜ 0.05）；與NL組比較，Res組大鼠SIRT1表達明顯升高，而HIF-1 α明顯降低 （P ＜0.05）。見圖3、表3。

2.6 各組大鼠SIRT1、HIF-1α mRNA 表達比較 （表3）

圖3 Western blotting檢測腎組織中SIRT1和HIF-1 α蛋白表達水平Fig.3 SIRT1 and HIF-1 α protein expression in the renal tissue of rats detected by Western blotting

表3 各組大鼠腎組織中SIRT1和HIF-1 α蛋白、mRNA表達水平Tab.3 SIRT1 and HIF-1 α protein and mRNA expression in the renal tissue of rats

qRT-PCR檢測SIRT1和HIF-1α mRNA水平，結(jié)果顯示，與Sham組比較，NL組大鼠HIF-1α mRNA表達明顯是升高，而SIRT1 mRNA表達明顯降低 （P ＜ 0.05）；與NL組比較，Res組大鼠SIRT1 mRNA表達明顯升高，而HIF-1α mRNA明顯降低 （P ＜ 0.05），與Western blotting結(jié)果一致，提示Res可以通過調(diào)控SIRT1、HIF-1 α蛋白表達，抑制腎小管上皮細胞凋亡，改善碘海醇所致的糖尿病大鼠腎損傷。

3 討論

本研究利用碘海醇建立糖尿病大鼠腎損傷模型，采用HE染色、 ELISA、 Western blotting、 qRT-PCR等技術(shù)，觀察Res對大鼠腎小管損傷、凋亡、氧化應(yīng)激及SIRT1和HIF-1 α蛋白表達影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Res可以減輕碘海醇導(dǎo)致的大鼠腎小管上皮細胞損傷，抗氧化應(yīng)激，抑制細胞凋亡，此外還發(fā)現(xiàn)Res可以上調(diào)碘海醇誘導(dǎo)糖尿病腎損傷大鼠腎臟組織中SIRT1蛋白表達，而使HIF-1 α蛋白表達顯著降低，提示Res可以減輕碘海醇誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎功能損傷，其機制可能與調(diào)控SIRT1及HIF-1 α蛋白表達，抑制細胞凋亡有關(guān)。

研究［13-14］表明，對比劑腎病已成為含碘對比劑注射之后的嚴重并發(fā)癥之一，僅次于腎灌注不足和腎毒性藥物，成為引起醫(yī)院獲得性腎衰竭的常見原因，約占醫(yī)源性急性腎功能衰竭的10%。糖尿病是對比劑腎病的危險因素之一，其發(fā)生機制尚不清楚，可能與腎臟血流動力學(xué)改變、腎臟低氧、低灌注、氧化應(yīng)激、炎癥、細胞損傷、對比劑造成的腎小管直接毒性作用等多種因素相關(guān)［15］。目前普遍認為對比劑對腎小管供氧平衡的破壞是損傷發(fā)生和發(fā)展的主要機制之一。正常情況下，人體存在氧自由基的產(chǎn)生和清除，SOD主要反映自由基造成的細胞傷害［16］，GPX能有效清除生物體內(nèi)的自由基［17］，MDA反映過氧化物損傷程度［18］，本研究利用對比劑碘海醇誘導(dǎo)糖尿病腎損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)建模48 h后，大鼠腎小管上皮細胞損傷，凋亡，細胞脫落至腎小管腔，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，血清總Scr、BUN、MDA均升高，T-SOD、GPX降低，提示碘海醇可以導(dǎo)致糖尿病大鼠腎功能損傷及腎小管上皮細胞凋亡，其機制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。

Res具有調(diào)節(jié)血脂水平、防止低密度脂蛋白氧化、抗血小板凝集、抗腫瘤、抗氧化及抗自由基的作用［19］，近年來Res在腎臟疾病中廣泛應(yīng)用，JEFREMOV等［20］研究發(fā)現(xiàn)Res可以有效清除金屬誘導(dǎo)基團和超氧化物，對活性氧 （reactive oxygen species，ROS）引起的DNA損傷具有保護作用。PALSAMY等［21］研究發(fā)現(xiàn)Res可以通過抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡對糖尿病腎病大鼠腎功能產(chǎn)生保護作用，但目前對于Res對對比劑腎病預(yù)防和治療機制尚未清楚，本研究利用Res干預(yù)碘海醇誘導(dǎo)糖尿病腎損傷大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Res可以減輕碘海醇引起的糖尿病大鼠腎小管損傷及凋亡，抑制其氧化應(yīng)激反應(yīng)，對碘海醇誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎損傷具有保護作用，其機制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

SIRT1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰酶，在細胞的分化、增殖、凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用［22］，HIF-1是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，是與缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展及腫瘤生長等作用相關(guān)的靶基因，與SIRT1關(guān)系密切［23］，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以通過調(diào)控HIF-1 α影響細胞凋亡，而關(guān)于缺氧組織內(nèi)HIF-1誘導(dǎo)或抑制細胞凋亡的機制，有研究［24］認為與Bcl-2和P53等基因有關(guān)，P53是凋亡相關(guān)基因，而Bcl-2 具有抑制凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)，建模48 h后，SIRT1表達明顯降低，而HIF-1 α表達明顯升高，提示碘海醇誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎損傷可能與調(diào)控SIRT1及HIF-1 α蛋白表達、促進腎小管上皮細胞凋亡有關(guān)，而Res可能通過調(diào)控SIRT1及HIF-1 α蛋白表達來抑制碘海醇誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小管上皮細胞凋亡。其機制可能與調(diào)控SIRT-1及HIF-1 α蛋白表達有關(guān)。