C1QBP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析

李維 張永紅 劉旋 張紅妮 鄧文靜 鐘玉潔 馬莉 張娜 楊拴盈

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 710004；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科 710004

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病,其發(fā)病受環(huán)境、基因等多因素影響,并且不易早期發(fā)現(xiàn),治療效果不佳。肺癌是我國(guó)近10年病死率最高的腫瘤[1],也是美國(guó)預(yù)測(cè)2018年病死率最高的腫瘤[2]。肺癌中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)達(dá)85%,近年來(lái),靶向治療及免疫治療在NSCLC的應(yīng)用,顯著延長(zhǎng)部分患者的疾病緩解期,但治愈肺癌的目標(biāo)仍任重而道遠(yuǎn),研究NSCLC發(fā)病機(jī)制尋找更有效的治療方法仍然是目前研究的重點(diǎn)。本課題前期通過(guò)肺腺癌線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究,篩選出一系列差異蛋白,其中補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白(complement component 1q subcomponent binding protein,C1QBP)在肺腺癌組織細(xì)胞和正常肺組織細(xì)胞間的差異超過(guò)2倍。C1QBP在多種腫瘤中表達(dá)均升高[3],而其與NSCLC的相關(guān)研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究將進(jìn)一步檢測(cè)組織標(biāo)本中C1QBP蛋白的表達(dá),結(jié)合臨床特征進(jìn)行分析,并對(duì)C1QBP進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為進(jìn)一步探究其在NSCLC發(fā)生中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源 46例肺癌組織標(biāo)本取自西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)病例標(biāo)本,其中24例同時(shí)收集癌旁＞5 cm 處正常肺組織標(biāo)本,其中男30例,女16例;年齡(57.7±8.6)歲,年齡范圍為43～75歲,其中＜60歲25例,≥60歲21例;組織低分化23例,高分化23例;根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟2017年第8版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期/Ⅱ期25例,Ⅲ期/Ⅳ期21例;24例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,22例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;腺癌26例,鱗癌20例。所有入選病例術(shù)前未經(jīng)放、化療,無(wú)肝硬化、自身免疫病等合并癥,術(shù)后經(jīng)病理確診為肺癌。組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片備用。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019002)。

1.2 主要試劑 兔抗人C1QBP 多克隆抗體(英國(guó)Biorbyt公司),SP9001生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),脫脂奶粉,其它實(shí)驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 石蠟組織標(biāo)本切成4μm切片,常規(guī)脫蠟和水化,加檸檬酸緩沖液后置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù),3%H2O2孵育,正常山羊血清封閉抗體,滴加稀釋的一抗兔抗人多克隆抗體C1QBP(1∶200),4 ℃冰箱過(guò)夜,滴加二抗工作液孵育,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素孵育,DAB顯色,蘇木精溶液復(fù)染,脫水,晾干后中性樹(shù)膠封片。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照,PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

由1位主治醫(yī)師和1位副主任醫(yī)師采取雙盲法進(jìn)行免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷[4],以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性,每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野,每個(gè)視野大于200個(gè)細(xì)胞。采用半定量積分法判定結(jié)果,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比(無(wú)細(xì)胞著色為0分;＜10%為1分;10%～50%為2分;＞50%為3分)和染色強(qiáng)度(未著色為0 分;淡黃色為1分;中度黃色為2分;棕黃色為3分)進(jìn)行評(píng)分,將2種分值相乘：0分為“-”,1～4分為“+”,＞4分為“++”。定 義“-”為陰性表達(dá),“+、++”為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 生物信息學(xué)分析 采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢C1QBP(Q07021)蛋白質(zhì)序列,在此基礎(chǔ)上,利用ExPASy中的ProtParam 在線工具進(jìn)行理化性質(zhì)分析。其中包括：氨基酸數(shù)量、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、理論p I值,氨基酸組成、分子式、蛋白半衰期、穩(wěn)定性、親/疏水性等。利用SOPMA、PDBe對(duì)C1QBP的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,利用TMpred和SMART 對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè),利用Prot Fun 2.2 Server進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分析,采用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)C1QBP相互作用蛋白,并分析可能作用的信號(hào)通路。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理,采用Fisher確切概率法分別分析腺癌和正常組織,鱗癌和正常組織的組間差異。C1QBP陽(yáng)性表達(dá)程度和患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤類型的關(guān)系采用Spearman系數(shù)進(jìn)行比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 在肺腺癌和鱗癌中C1QBP以棕黃色顆粒主要表達(dá)于胞漿,在高表達(dá)的組織中細(xì)胞核也有表達(dá),而在正常肺組織中表達(dá)量很少(圖1～3)。在肺腺癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率為92.31%(24/26),而在正常肺組織中表達(dá)陽(yáng)性率為37.50%(9/24)(P＜0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在肺鱗癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率為95.00%(19/20),與正常肺組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),見(jiàn)表1。進(jìn)一步采用Spearman相關(guān)系數(shù)來(lái)分析C1QBP 陽(yáng)性表達(dá)的程度和患者年齡、性別、腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤類型的關(guān)系(表2)。研究結(jié)果提示,C1QBP 陽(yáng)性表達(dá)的程度和患者的年齡、性別、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤類型均無(wú)關(guān),和患者腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)。

圖1 補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白在肺腺癌中的表達(dá)IHC ×400

圖2 補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白在肺鱗癌中的表達(dá)IHC ×400

圖3 補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白在癌旁正常肺組織的表達(dá) IHC ×400

表1 C1QBP在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)(例)

表2 C1QBP表達(dá)的分級(jí)和患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系(例)

2.2 生物信息分析結(jié)果 C1QBP 蛋白全序列由282 個(gè)氨基酸組成,蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為31 362.24,理論p I為4.74,其組成中含量相對(duì)較多的氨基酸包括：谷氨酸10.3%,亮氨酸11.0%,天冬氨酸7.1%,色氨酸7.1%,甘氨酸7.1%。分子式為：C1379H2169N375O440S10。哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞體外研究估計(jì)半衰期為30 h。C1QBP的不穩(wěn)定系數(shù)為48.69,提示該蛋白是不穩(wěn)定的。而脂溶指數(shù)為79.86,其總的平均親水性系數(shù)(GRAVY)為-0.461。

UniProt KB在線查詢C1QBP(Q07021)的氨基酸序列見(jiàn)圖4,SOPMA 軟件對(duì)C1QBP 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),主要包括無(wú)規(guī)則彎曲(47.87%)、α-螺旋(32.98%)、延 伸 鏈(15.25%)、β 轉(zhuǎn) 角(3.90%),見(jiàn)圖5、6。在PDBe 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢C1QBP的三級(jí)結(jié)構(gòu)已知為：3RPX(圖7)。

圖4 補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白的氨基酸序列

圖5 SOPMA 軟件對(duì)補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖6 SOPMA 軟件對(duì)補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分布圖

運(yùn)行在線工具TMpred對(duì)C1QBP 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果提示并未發(fā)現(xiàn)有顯著意義的跨膜結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用在線工具SMART 發(fā)現(xiàn)C1QBP蛋白質(zhì)在序列的86-279 位氨基酸之間存在MAM33結(jié)構(gòu)域(圖8)。

圖7 PDBe數(shù)據(jù)庫(kù)中補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖8 SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)中的補(bǔ)體成分1q亞單位結(jié)合蛋白蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域

利用Prot Fun 2.2 Server對(duì)C1QBP 進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn),C1QBP 最有可能的功能分類依次是：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)、激素等(表3)。

表3 Prot Fun 2.2 Server中C1QBP功能初步分析結(jié)果

采用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)C1QBP相互作用蛋白。STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)擴(kuò)大了相互作用的預(yù)測(cè)范圍,該數(shù)據(jù)庫(kù)包含了直接(物理上)和間接(功能上)的各種相互作用關(guān)系,數(shù)據(jù)結(jié)果根據(jù)基因背景、高通量實(shí)驗(yàn)、共表達(dá)和已知信息綜合所得,并對(duì)每一個(gè)相互作用關(guān)系進(jìn)行評(píng)分,該數(shù)據(jù)庫(kù)目前涵蓋了來(lái)自1 133個(gè)物種的5 214 234種蛋白質(zhì)的相互作用信息。STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)C1QBP 評(píng)分最高的10種蛋白質(zhì)依次為： 激肽原1(kininogen-1,KNG1)、血漿激肽釋放酶、凝血因子Ⅻ(coagulation factorⅫ,F12)、脯氨酰羧肽酶、凝血因子Ⅺ(coagulation factor Ⅺ,F11)、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族G1、富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1、糖蛋白9、α-2-巨球蛋白、血小板膜糖蛋白(圖9)。

圖9 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中C1QBP相互作用蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

C1QBP又稱人透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白、P32 或gC1q R,為酸性蛋白,主要定位于線粒體,也可存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等其他部位[5]。編碼C1QBP 旳基因位于人染色體17p12-13[6],包括6 個(gè)外顯子和5 個(gè)內(nèi)含子。蛋白質(zhì)的一、二及三級(jí)結(jié)構(gòu)是它的功能的基礎(chǔ),最終形成的成熟的C1QBP蛋白具有特殊的晶體結(jié)構(gòu)：3個(gè)單體分子形成1個(gè)中空?qǐng)A環(huán)型的三聚體,并有1個(gè)三重對(duì)稱軸,這種結(jié)構(gòu)大大提高了其與配體的結(jié)合能力[7]。在線工具SMART 發(fā)現(xiàn)的C1QBP 結(jié)構(gòu)域MAM33,是結(jié)合C1Q 球型頭部結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵,和線粒體氧化磷酸化及細(xì)胞核與線粒體的相互作用有關(guān),在C1QBP的功能中有重要作用[8]。

ProtFun 2.2 Server分析結(jié)果表明C1QBP 最有可能的功能分類依次是：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)等。生物信息學(xué)分析C1QBP缺乏跨膜結(jié)構(gòu),并且是不穩(wěn)定蛋白,因此,其只有通過(guò)與其他跨膜蛋白相互作用來(lái)傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。C1QBP 脂溶指數(shù)達(dá)79.86,親水性系數(shù)為負(fù)值,既有親水部分,又有疏水部分,為和其他蛋白的結(jié)合奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。C1QBP通過(guò)L1CAM 影響腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移,并通過(guò)調(diào)節(jié)GSK3/β-Catenin/L1CAM信號(hào)通路調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9];鋅指蛋白32是氧化劑刺激后細(xì)胞存活的關(guān)鍵,C1QBP 是鋅指蛋白32的直接靶基因,兩者結(jié)合使p38MAPK 途徑失活,從而發(fā)揮鋅指蛋白32對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[10]。C1QBP 還可與C1Q 結(jié)合可以調(diào)節(jié)多種免疫應(yīng)答[11],抑制淋巴細(xì)胞的增殖,影響成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附等。C1QBP 與SF2/ASF/SRSF1結(jié)合,激活m TOR C1信號(hào)通路引起細(xì)胞增殖[12]。因此,C1QBP是一種多功能伴侶蛋白,有多種不同的生物功能[13]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NSCLC 和正常肺組織C1QBP的表達(dá),發(fā)現(xiàn)肺腺癌和鱗癌組織中C1QBP的表達(dá)明顯高于正常肺組織,并且表達(dá)陽(yáng)性的程度和腫瘤組織分化程度呈正相關(guān),但未發(fā)現(xiàn)和肺癌的TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。查閱文獻(xiàn),C1QBP 在乳腺癌[14]、卵巢癌[15]、子宮內(nèi)膜癌[16]、胃癌[17]、肝癌[18]、結(jié)腸癌[19]和宮頸癌[20]等多種腫瘤組織中表達(dá)增多。在乳腺癌中,C1QBP的m RNA 和蛋白水平在乳腺癌組織中的表達(dá)與正常組織相比明顯升高[21],并和乳腺癌患者的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的復(fù)發(fā)相關(guān),C1QBP 高表達(dá)是乳腺癌的不利預(yù)后因素[22-23],C1QBP可能是診斷乳腺癌的分子標(biāo)志物。在卵巢癌組織中,C1QBP 蛋白水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]。在子宮內(nèi)膜癌組織中,C1QBP 的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的惡性程度、腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后相關(guān)[16],C1QBP可能是子宮內(nèi)膜癌的獨(dú)立預(yù)后因素。雖然本研究未發(fā)現(xiàn)C1QBP表達(dá)的強(qiáng)弱和肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān),但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果C1QBP在肺腺癌和鱗癌中表達(dá)升高是肯定的,因此,C1QBP和肺癌的發(fā)生很可能有關(guān),有望成為NSCLC新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的C1QBP相關(guān)蛋白中得分最高的是KNG1,KNG1是高相對(duì)分子質(zhì)量激肽原、低相對(duì)分子質(zhì)量激肽原和緩激肽的前體,C1QBP可以招募C1Q 和高相對(duì)分子質(zhì)量激肽原形成強(qiáng)大的血管生成因素,促進(jìn)腫瘤新生血管的形成,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[24]。腫瘤細(xì)胞在增殖中C1QBP增多,C1QBP會(huì)通過(guò)中和補(bǔ)體來(lái)防止宿主介導(dǎo)的細(xì)胞損傷,使腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體的免疫系統(tǒng),增加存活的機(jī)會(huì)。C1QBP 還能夠激活補(bǔ)體和激肽釋放酶系統(tǒng)來(lái)形成有效的血管活性肽,包括緩激肽,從而增加血管的滲漏,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的逃逸,促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成[25]。由此可見(jiàn),C1QBP在腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、血管生成和轉(zhuǎn)移中均有重要作用,以C1QBP為治療靶點(diǎn),可以起到廣泛的抗腫瘤作用[13]。

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù) 預(yù) 測(cè) 的C1QBP 相 關(guān) 的10 個(gè)蛋白中有7 個(gè)蛋白(KNG1、血漿激肽釋放酶、F12、F11、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族G1、糖蛋白9、血小板膜糖蛋白)均和凝血有關(guān)。現(xiàn)有研究表明,凝血酶與其凝血酶受體1 結(jié)合經(jīng)p44/42 MAPK 信號(hào)通路途徑可提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子m RNA 的穩(wěn)定性,增強(qiáng)VEGF 合成及釋放,為腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移提供血供;同時(shí)通過(guò)降低內(nèi)皮細(xì)胞與膜基底蛋白的連接能力,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解,利于腫瘤細(xì)胞遷移[26]。F12和F11這2個(gè)凝血因子均在凝血過(guò)程中和凝血酶有重要聯(lián)系,F12 和F11也是和C1QBP有重要聯(lián)系的蛋白,由此推測(cè),C1QBP也可能通過(guò)p44/42 MAPK 這一信號(hào)通路引起肺腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移,這是我們下一步研究的重要方向。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了C1QBP在NSCLC 中的表達(dá)明顯升高,生物信息學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證了C1QBP 和腫瘤的相關(guān)性,并推測(cè)了可能的作用機(jī)制。因此,C1QBP 很可能成為NSCLC新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),但其確切的診斷及治療價(jià)值和作用機(jī)制,仍需進(jìn)一步的深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突