H10亞型和N8亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測方法的建立

羅思思，謝芝勛，謝志勤，謝麗基，鄧顯文，范 晴，黃嬌玲，張艷芳，王 盛，曾婷婷，張民秀

(廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西獸醫生物技術重點實驗室， 南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)根據表面糖蛋白(hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶(neuraminidase, NA)抗原性差異分為不同的亞型，目前已發現有18種HA亞型(H1-H18)和11種NA亞型(N1-N11)[1-2]。2013年12月6日，江西省南昌市一名73歲女子罹患H10N8甲型禽流感，因呼吸衰竭、休克死亡，全球首次發現人類感染H10N8亞型AIV可導致死亡。截至2014年2月15日，在江西共確診3人感染H10N8亞型AIV，其中2人死亡[3-4]。H10和N8亞型AIV在家禽和野鳥散發，主要是H10N7和H3N8[5]。H10N8亞型AIV感染人雖散發，但是否存在后續的感染，或是否存在H10亞型和其他N亞型、其他H亞型和N8亞型的感染，均需監測H10和N8亞型AIV的感染情況，因此，十分有必要建立一種同時鑒定H10亞型和N8亞型AIV的檢測方法，為這兩個亞型的檢測提供有效方法和技術儲備。

目前，診斷H10亞型和N8亞型AIV的方法主要是病毒分離鑒定，作為診斷的金標準，結果準確可靠，但存在檢測周期長的缺點；免疫熒光和酶聯免疫吸附試驗均需特定的陽性血清，在實際應用中有一定的局限性。多重RT-PCR是在普通RT-PCR基礎上發展而來的，已成功應用于很多病原體的檢測[6-8]。H10亞型和N8亞型的分子生物學檢測方法十分欠缺，本研究旨在建立一種同時檢測H10亞型、N8亞型和所有亞型AIV的三重RT-PCR方法，同時對3個目的基因進行擴增，以節約檢測試劑，簡化反應程序。

1 材料與方法

1.1 毒株和主要試劑 AIV毒株(H3N8、H6N8、H1N1、H3N2、H4N6、H6N1、H9N2和H11)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和傳染性法氏囊病毒(IBDV)由廣西獸醫研究所分離鑒定保存；AIV毒株(H2N3、H8N4、H10N3、H12N5)由香港大學惠贈；AIV毒株(H10N7、H5N1、H7N2、H13N6、H14N5、H15N9和H16N3)cDNA由美國康涅狄格大學惠贈；AIV毒株(H1N7和H11N9)由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈。Minibest viral RNA/DNA extraction kit ver.4.0和反轉錄試劑和PCR premix購自大連寶生物公司。

1.2 引物設計 根據基因庫中H10亞型AIV 的HA基因、N8亞型AIV的NA基因和所有亞型AIV的M基因，用DNAStar軟件比對序列找出保守區域，用primer 5.0軟件分析引物的擴增條件，每個基因均設計了3對特異性引物，并用NCBI Blast初步驗證引物的特異性。序列送至廣州invitrogen公司合成。引物合成后，通過實際試驗進行平行篩選，最終各自篩選出最佳的1對引物(表1)，用于H10亞型、N8亞型和所有亞型AIV的檢測。

表1 引物信息Tab 1 The information of primers

1.3 病毒RNA提取與RT-PCR反應條件的優化

按照Minibest viral RNA/DNA extraction試劑盒說明書抽提病毒RNA，并將RNA反轉錄為cDNA。PCR反應體系25 μL：2×PCR premix 12.5 μL，正、反引物終濃度在0.1～0.6 μmol/L之間調整，cDNA 2 μL，以無RNA酶的超純水補足25 μL。反應程序如下： 94 ℃ 5min；94 ℃ 40 s, 50～57 ℃之間調整 40 s, 72 ℃ 40 s, 30個循環；72 ℃ 10 min。

1.4 標準品的制備 用HA、NA和M基因全長引物，分別以H10亞型、N8亞型AIV和任一亞型AIV的RNA為模板進行RT-PCR擴增，得到基因全長的目的片段，將這3個基因片段分別連接至pGEM T-easy載體上，將含有HA、NA和M基因片段的正確序列的重組質粒分別命名為H10、N8和M。

1.5 特異性試驗 按照優化好的反應條件，用所建立H10亞型和N8亞型AIV三重RT-PCR檢測方法對1.1項所列毒株的RNA/DNA進行檢測，檢驗其特異性。

1.6 敏感性試驗 將“1.4”構建好的重組質粒進行等比例混合，并將混合質粒10倍梯度稀釋，按照優化好的反應條件，用所建立的方法對其進行PCR擴增，檢驗其敏感性。

1.7 臨床樣品檢測 用所建立的方法對120份活禽市場棉拭子(同一只家禽的咽喉、泄殖腔拭子為一份)樣品進行檢測，同時將這120份樣品接種10日齡SPF雞胚增殖病毒，用血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)對尿囊液進行HA亞型的鑒定，將鑒定過的HA毒株，用NA基因全長引物PCR擴增和測序，確定NA亞型。

2 結果與分析

2.1 反應條件的優化 通過引物之間濃度的優化，H10-F和H10-R引物終濃度為0.2 μmol/L，N8-F和N8-R引物終濃度為0.4 μmol/L，M-F和M-R引物終濃度為0.2 μmol/L。通過退火溫度的優化，確定最佳退火溫度為52 ℃。

2.2 特異性試驗 該法對H10和N8亞型AIV的混合模板擴增出3條特異性條帶，分別為267、464和693 bp；對H10Ny(如H10N7、H10N3，y≠8)亞型AIV擴增出2條特異性條帶，片段大小為267和693 bp；對HxN8(如H6N8、H3N8，x≠10)亞型AIV擴增出2條特異性條帶，片段大小為464和693 bp；對其他亞型AIV擴增出693 bp M基因通用檢測的條帶；而常見禽病病原體均未擴增出任何條帶。所有毒株的擴增結果均與實際相符，表明該法特異性強。部分毒株的擴增結果見圖1。

2.3 敏感性試驗 該法對濃度為108～10拷貝/μL的H10、N8和M混合質粒進行敏感性測定，圖2結果顯示：濃度為108～104拷貝/μL的混合質粒均有3條明顯的擴增條帶出現，片段大小分別為267 bp(H10)、464 bp(N8)、693 bp(M)；濃度為103拷貝/μL的混合質粒有2條明顯的擴增條帶出現，片段大小分別為267 bp(H10)、464 bp(N8)，已檢測不到693 bp M基因條帶；濃度為100拷貝/μL混合質粒的檢測均無擴增條帶。結果表明，H10和N8亞型AIV的最低檢測限為103拷貝/μL，AIV M基因引物最低檢測限為104拷貝/μL。

M. 100 bp Marker; 1. H10+N8; 2. H10N7; 3. H6N8; 4. H1N1; 5. H1N7; 6. H2N3; 7. H3N2; 8. H4N6; 9. H5N1; 10. H6N1; 11. H7N2; 12. H8N4; 13. H9N2; 14. H11N9; 15. H12N5; 16. H13N6; 17. H14N5; 18. H15N9; 19. H16N3; 20. NDV;21. IBV; 22. ILTV; 23. IBDV; 24. 空白對照圖1 特異性試驗結果Fig 1 The results of specificity test

M. 100 bp Marker; 1. 108拷貝/μL; 2. 107 拷貝/μL; 3. 106 拷貝/μL; 4. 105 拷貝/μL; 5. 104 拷貝/μL; 6.103拷貝/μL; 7. 100拷貝/μL; 8.陰性對照圖2 敏感性試驗結果Fig 2 The results of sensitivity test

2.4 臨床樣品檢測 用所建立的H10N8亞型AIV三重RT-PCR方法對120份活禽市場樣品進行檢測，結果檢出2份H10Ny亞型AIV(y≠8)，3份HxN8(如x≠10)，與HI和測序結果一致。

3 討論與結論

在2013年12月江西發現人類感染H10N8之前，公共資源只能查到26株H10N8的序列;H10亞型曾有感染人的報道，分別是2004年埃及H10N7和2010年澳大利亞H10N7，病人出現結膜炎和輕度呼吸道癥狀，N8亞型未有感染人的報道[5];我國僅有兩例H10N8亞型AIV感染家禽的報道，一株是2007年從湖南洞庭湖濕地抽檢的水樣中分離到的[9]，被命名為A/environment/Dongting Lake/Human/3-9/2007(H10N8)，另一株則是于2012年1月從廣東活禽市場的鴨中分離出來[10]，被命名為A/Duck/Guang-dong/E1/2012(H10N8)。此次江西人類感染株與之前的H10N8不同，尤其6個內部基因均來源于H9N2。2013年爆發的H7N9毒株的6個內部基因也來源于H9N2，但H10N8的6個內部基因與H7N9不同。有報道對江西第一例H10N8亞型AIV人類感染株(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)的受體結合特性進行了研究，結果表明對人源受體親和力極弱，并不具備在人群中傳播的能力[4]。

目前，H10N8感染人有3個病例，在人類屬于散發，但已能在活禽市場中分離出雞H10N8[11]。我們對廣西活禽市場進行AIV調查，H10較多與其他亞型混合感染，尚未單獨分離出H10亞型，N8亞型鑒定出的有H3N8、H4N8、H6N8，尚未分離出H10N8毒株[12]。由于樣品限制，并未用H10N8毒株對該法進行驗證，在特異性試驗中，只用H10和N8亞型混合模板來驗證該三重RT-PCR的特異性，還需更多臨床樣品對該法進行驗證。基于我們對AIV的日常監測，發現相比以前，H10亞型和N8亞型分離率有所增加，并鑒于發生了H10N8感染人的案例，且之前就有H10亞型與其他N亞型(H10N7、H10N2、H10N1)[13-15]，其他H亞型與N8亞型的報道(H3N8、H4N8、H6N8)，因此本研究想建立同時鑒定H10亞型和N8亞型AIV檢測方法，對這兩個亞型進行追蹤檢測，為AIV的有效防控提供參考資料。

本研究將M基因通用檢測所有亞型AIV的引物，與H10亞型、N8亞型AIV的引物混合在同一反應體系中，對樣品中含有H10亞型和N8亞型的，多一道驗證其確屬AIV的感染，對樣品中含有其他亞型AIV的，也能檢測出，讓我們了解到是否存在AIV的感染，為是否需要進一步確認其他亞型AIV提供參考。引物設計和濃度的優化是該法成功建立的關鍵。本研究針對H10、N8和M基因序列保守區域，結合primer 5.0軟件的引物參數，初步篩出候選引物，再用NCBI-BLAST模擬檢查引物的特異性，但引物是否真正可行，還需經過實際的試驗來驗證。通過優化3對引物之間的濃度，用單一模板(H10亞型、N8亞型、不同亞型AIV)、混合模板(H10和N8亞型)和常見禽病病原體作為模板對該法進行特異性的驗證，用含有H10、N8和M基因的質粒標準品進行敏感性測定，結果表明所建立的H10亞型和N8亞型AIV三重RT-PCR檢測方法特異性強、敏感性高，一管即可檢測H10、N8和M三個目的基因，具有有效、簡便、快速、省時省力的優點，為H10亞型和N8亞型AIV調查監測提供技術支持。