miR-152-3p靶向IGF1基因對高糖誘導的ARPE-19細胞活性和凋亡的影響

李 博，陳金鵬，胡 璇，吳淑君，瞿文博

0引言

糖尿病視網膜病變是糖尿病嚴重并發癥之一，其發病率隨著糖尿病發病率的升高而逐年上升。糖尿病視網膜病變是糖尿病常見的微血管病變之一，具有特異性改變的眼底，引起患者視力嚴重受損，影響著患者的身心健康[1]。糖尿病視網膜病變的特征是毛細血管周細胞早期丟失和基底膜增厚，這可能導致內皮細胞過度增殖，并隨后導致血管生成[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能夠促進血管生成，增強毛細血管細胞通透性，參與糖尿病視網膜病變[3]。據報道，高葡萄糖可增加視網膜色素上皮細胞和血管內皮細胞中VEGF蛋白水平，且糖尿病視網膜病變和其他與新生血管形成相關的眼部疾病中VEGF水平亦增加[4]。因此，通過了解其發展和進展的分子機制，開發針對糖尿病視網膜病變的新型治療策略具有重要的意義。微小RNA(miRNA)是一類新的小型、高度保守的非編碼RNA，可作為轉錄后調節因子。它們與靶mRNA的3’-UTR結合，并通過誘導mRNA降解或抑制蛋白質翻譯來調節轉錄后水平的基因表達[5]。最近研究發現miRNA在糖尿病及其并發癥中發揮重要調控作用[6-7]。miR-152-3p屬于高度保守的miRNA家族，它調節血管生成因子的釋放，可能參與控制血管完整性和血管生成，這對糖尿病視網膜病變的發展至關重要[8-9]。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)是與多種生物學特性相關的重要生長因子，如細胞增殖、分化、存活和成熟等[10]。據報道IGF1參與視網膜增殖膜的發展，這是一層病理組織，是糖尿病視網膜病變非常重要的病理條件[11]。前期研究[12-13]發現miR-206通過靶向IGF1增強鼻咽癌的放射敏感性，miR-422a通過靶向IGF1抑制膠質瘤的增殖和侵襲。本研究前期通過生物信息學軟件預測得到miR-152-3p與IGF1存在靶向結合位點。本實驗確定了miR-152-3p與IGF1 mRNA直接相互作用，以調節高糖條件下ARPE-19細胞中VEGF的表達。結果表明miR-152-3p及其靶向IGF1可能為糖尿病視網膜病變的治療提供新的見解。

1材料和方法

1.1材料ARPE-19細胞株購自中國科學院武漢細胞庫；DMEM高糖和正常糖培養基、脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、Trizol試劑購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自杭州四季青工程材料有限公司；miR-152-3p mimics及mimics control購自上海吉瑪制藥技術有限公司；二甲基亞砜購自上海生工生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；SYBR premix Ex Taq試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；MTT購自美國Sigma公司；VEGF抗體、IGF1抗體、GAPDH抗體及二抗購自美國Abcam公司。pGLO載體購自美國Pronema公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養ARPE-19細胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，在37℃，5%CO2培養箱中培養。每天觀察培養瓶中貼壁細胞生長和增殖情況，每2d換液1次，待細胞生長匯合達90%時，棄原細胞培養液，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。取生長狀態良好且屬同一代的細胞用于后續實驗。

1.2.2實驗分組對數生長期的ARPE-19細胞接種于96孔板中，置37℃培養箱繼續培養24h，用不含血清培養基更換原培養基，饑餓處理12h使細胞同步化。將細胞隨機分為四組：(1)正常對照組：含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培養基；(2)高糖組：含30mmol/L葡萄糖的DMEM培養基；(3)高糖+miR-152-3p組：細胞轉染miR-152-3p mimics后以含30mmol/L葡萄糖的DMEM培養基干預；(4)高糖+NC組：細胞轉染mimics control后以含30mmol/L葡萄糖的DMEM培養基干預。細胞轉染采用脂質體轉染法，具體操作步驟參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行。各組細胞置37℃培養箱中繼續培養。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖情況正常對照組、高糖組、高糖+miR-152-3p組和高糖+NC組細胞接種于96孔板，接種密度為2×104個細胞，置37℃培養箱分別培養24、48、72h，各個時間點在每孔細胞中添加MTT溶液(濃度為5mg/mL)10μL，37℃孵育4h，吸去上清液后再在每孔細胞中添加二甲基亞砜100μL，于震蕩儀上振蕩10min，至沉淀完全溶解，用酶標儀在波長490nm處讀取吸光度值(A值)，計算各組ARPE-19細胞增殖活性。

1.2.4流式細胞術檢測正常對照組、高糖組、高糖+miR-152-3p組和高糖+NC組細胞培養48h后，用胰蛋白酶消化貼壁生長的細胞，離心收集細胞至1.5mL EP管中，用凋亡孵育緩沖液沖洗并重懸細胞，調整細胞密度為2×106個，分別在細胞中添加Annexin Ⅴ-FITC 5μL，室溫避光反應15min，再加入PI染液5μL，4℃避光孵育30min，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，統計細胞凋亡率。

1.2.5熒光定量PCR檢測以上各組ARPE-19細胞處理48h后以Trizol法提取細胞中總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。采用SYBR premix Ex Taq試劑盒進行熒光定量PCR擴增。反應條件為95℃ 5min，95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 20s，共40個循環。得出的Ct值采用2-△△Ct法計算相對表達水平，以U6為內參，計算miR-152-3p相對表達水平，所用引物如下：miR-152-3p上游:5’- ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAG -3’; 下游：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA-3’。U6上游:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.6 Western blot檢測以上四組ARPE-19細胞處理48h后，分別收集各組細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后用預冷的PBS洗滌細胞3次，分別加入蛋白裂解液置冰上裂解細胞，提取細胞中總蛋白。取等量蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，分離蛋白后將凝膠上的蛋白質轉印至硝酸纖維素膜上。以質量分數為5%脫脂奶粉封閉液中反應2h，常規加入一抗VEGF(1∶500稀釋)、IGF1(1∶800稀釋)、GAPDH(1∶500稀釋)，4℃過夜孵育。PBST洗膜3次，加入二抗(1∶3000稀釋)室溫孵育2h。PBST洗膜3次，以ECL化學發光，顯影、定影，成像系統拍照，以Image J圖像分析系統分析個條帶灰度值。GAPDH為參照，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗采用生物信息學TargetScan軟件預測miR-152-3p與IGF1基因存在靶向結合位點，擴增與miR-152-3p結合的IGF1 3’-UTR序列并構建到pGLO載體上，同時將進行結合位點序列點突變的IGF1 3’-UTR序列并構建到pGLO載體上，采用脂質體轉染將重組載體IGF1-WT-pGLO或IGF1-MUT- pGLO與miR-152-3p mimics共轉染于ARPE-19細胞，同時設置共轉染mimics control為對照，培養48h后分別收集各組細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞中海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，以二者比值表示相對熒光素酶活性。

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

表1 各組ARPE-19細胞相對細胞活性比較

注：aP<0.05vs正常對照組；cP<0.05vs高糖+NC組。

表2 各組ARPE-19細胞miR-152-3p、IGF1和VEGF表達水平比較

注：aP<0.05vs正常對照組；cP<0.05vs高糖+NC組。

2結果

2.1 MTT法檢測各組ARPE-19細胞活性MTT法檢測顯示，處理24h時，與正常對照組比，高糖組ARPE-19細胞相對細胞活性降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組ARPE-19細胞相對細胞活性升高，差異也無統計學意義(P>0.05)。處理48、72h時，與正常對照組比，高糖組ARPE-19細胞相對細胞活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組ARPE-19細胞相對細胞活性升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖組比，高糖+NC組相對細胞活性無統計學意義(P>0.05)，見表1。提示高糖處理能夠抑制ARPE-19細胞活性，轉染miR-152-3p mimics能夠逆轉高糖誘導的細胞活性抑制作用。

圖2 Western blot檢測各組細胞中IGF1和VEGF蛋白水平。

2.2流式細胞儀檢測各組ARPE-19細胞凋亡率各組細胞處理48h后，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況(圖1)，正常對照組、高糖組、高糖+miR-152-3p組和高糖+NC組細胞凋亡率分別為(3.15±0.36)%、(12.59±1.16)%、(5.44±0.61)%、(13.14±1.18)%。與正常對照組比，高糖組ARPE-19細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組ARPE-19細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖組比，高糖+NC組細胞凋亡率無統計學意義(P>0.05)。提示高糖處理能夠誘導ARPE-19細胞凋亡，轉染miR-152-3p mimics能夠回調高糖誘導的細胞凋亡。

2.3各組ARPE-19細胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表達水平RT-PCR和Western blot檢測處理48h各組細胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表達水平，見圖2，表2。與正常對照組比，高糖組miR-152-3p表達水平明顯降低，IGF1和VEGF蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與高糖+NC組比，高糖+miR-152-3p組miR-152-3p表達水平明顯升高，IGF1和VEGF蛋白表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與高糖組比，高糖+NC組細胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表達水平均無統計學意義(P>0.05)。提示高糖處理能夠下調ARPE-19細胞中miR-152-3p的表達，上調IGF1和VEGF的表達；轉染miR-152-3p mimics能夠上調miR-152-3p的表達，且可抑制IGF1和VEGF的表達。

圖3 miR-152-3p與IGF1 3’-UTR靶向結合位點示意圖。

表3 miR-152-3p靶向IGF1 3’-UTR相對熒光素酶活性比較

注：aP<0.05vsmimics control組。

2.4雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-152-3p靶向調控IGF1通過生物信息學軟件TargetScan分析結果顯示，IGF1是miR-152-3p的靶基因，二者靶向結合位點見圖3。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，IGF1-WT-pGLO共轉染中與mimics control組比，miR-152-3p mimics組相對熒光素酶活性明顯降低，差異有統計學意義(t=10.775，P<0.05)；IGF1-MUT-pGLO共轉染中與mimics control組比，miR-152-3p mimics組相對熒光素酶活性無明顯改變，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。提示IGF1是miR-152-3p的靶基因。

3討論

ARPE-19細胞是視網膜色素上皮細胞中最常用于體外研究的細胞之一，本研究以ARPE-19細胞為基礎，探究糖尿病視網膜病變的相關機制。糖尿病視網膜病變的特征在于毛細血管周細胞的早期脫落和由此導致的血管生成[14]。IGF1通常由肝細胞合成和分泌，并通過與特異性受體IGF1R的結合發揮作用，在結構上，IGF1與前胰島素高度同源。有證據表明IGF1基因參與了糖尿病視網膜病變的發展[15]。與此一致，本研究表明，與正常對照組ARPE-19細胞相比，高糖能夠誘導ARPE-19細胞中IGF1的高表達。最近，隨著研究的深入，發現微小RNA參與糖尿病相關并發癥的發生和進展[16]。目前報道[17]顯示幾種miRNA在高血糖條件下差異表達。在本實驗中，高糖降低了視網膜色素上皮細胞ARPE-19中miR-152-3p的表達。提示IGF1與miR-152-3p的表達呈負相關性。在本研究中，預測miR-152-3p是靶向IGF1的miRNA，因此推測miR-152-3p靶向IGF1可能參與糖尿病視網膜病變的發病機制。在多種類型的癌細胞中miR-152-3p的表達降低，有研究顯示miR-152-3p通過靶向TMM 97在前列腺癌中扮演抑癌因子的作用[18]，還可調節膠質瘤細胞凋亡和侵襲調控[19]。據報道，血漿hsa-miR-152-3p水平與2型糖尿病患者的糖尿病腎病有關[20]。因此本研究前期使用生物信息學軟件TargetScan預測IGF1和miR-152-3p之間存在靶向結合關系。為驗證miR-152-3p和IGF1之間的靶向調節關系，本實驗構建了IGF1-WT-pGLO和IGF1-MUT-pGLO熒光素酶載體。結果顯示，當用IGF1-WT-pGLO熒光素酶載體轉染細胞時，miR-152-3p過表達抑制相對熒光素酶活性表達，但在IGF1-MUT-pGLO組中未被抑制。這些結果證明IGF1是miR-152-3p的靶基因。

VEGF是與血管生成、癌發生和轉移相關的關鍵調節因子。胰島素上調VEGF表達，這種作用是由胰島素受體介導的[21]。胰島素對VEGF表達的上調已被認為是糖尿病視網膜病變惡化的潛在解釋[22]。VEGF的過表達是糖尿病視網膜微血管病理性增生的重要原因之一。高糖誘導能夠導致VEGF的分泌增加[23]，與本研究一致。本研究通過高糖誘導，可促進ARPE-19細胞中VEGF表達。此外本實驗還發現高糖孵育48h后ARPE-19細胞活性顯著降低，凋亡率升高。因此，高糖誘導的VEGF表達的增加，被認為是ARPE-19細胞活性降低、凋亡增加的可能原因。為了進一步證實miR-152-3p對VEGF表達的抑制作用以及ARPE-19細胞活力和凋亡是通過靶向IGF1實現的，本實驗用miR-152-3p的模擬物轉染細胞進行IGF1和VEGF表達的干擾。結果顯示，轉染miR-152-3p mimics抑制了ARPE-19細胞中IGF1和VEGF的表達，上調miR-152-3p的表達可部分逆轉高糖處理的細胞活力的降低及凋亡的增加。

總之，本研究的結果表明，miR-152-3p的過表達抑制了IGF1的表達，導致VEGF途徑蛋白的下調，回調了ARPE-19細胞活力，減少細胞凋亡。本研究進一步闡明了糖尿病視網膜病變的發病機制，miR-152-3p可能成為糖尿病視網膜病變的潛在治療靶點。