利用飼養細胞體外擴增高純度的效應NK細胞

郭振興， 張艷慧， 劉紹輝

(1. 同濟大學醫學院，上海 200092； 2. 山東省千佛山醫院兒科，濟南 250014)

自然殺傷(nature killer, NK)細胞是一類大顆粒淋巴細胞，表型為CD3-CD56+，發源于骨髓，主要分布于外周血、肝臟和脾臟[1-2]。在功能上，NK細胞介于固有免疫和適應性免疫之間，具有一定的記憶性[3-6]。然而NK細胞僅占人體外周血細胞的5%～15%，且大多數處于未激活狀態。NK細胞的體外擴增技術仍不成熟，限制了NK細胞臨床應用的普及[7-8]。

本方案采用飼養細胞(FC)來擴增外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的NK細胞，通過FC胞膜表面所表達的表面分子與目的細胞的相互作用，選擇性地刺激目的細胞的增殖。Phan等[9]利用構建的GE_K562細胞(K562-mbIL15-41BBL)共培養人PBMC 21d后，NK細胞增殖達到977倍左右[10]。本研究在此基礎上構建了兩類FC，即第1代FC(FC-000，K562-41BBL)及第2代FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)。兩者的主要區別是是否帶有膜結合型的IL-15及IL-21，這兩類細胞因子均具有促進NK細胞增殖的作用。本研究通過比較兩類FC對NK細胞增殖的影響并通過NK細胞群的表型鑒定、功能作用的驗證來確定最優FC，以優化NK細胞的擴增技術。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞

人非小細胞肺癌細胞系A549于美國模式培養物集存庫獲得；FC是通過慢病毒轉導K562細胞系所構建而來，即第1代FC(FC-000，K562-41BBL)及第2代FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)；重組人白細胞介素2(rhIL-2)購自PeproTech公司；RPMI 1640培養基、DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和青/鏈霉素購自Hyclone公司；慶大霉素購自上海中西制藥有限公司；淋巴細胞分離液購自CEDARLANE公司；吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)購自Nexcelom Bioscience公司；流式抗體均購于BD公司。

1.2 樣本及細胞培養方法

人PBMCs樣本來源于健康供體的新鮮外……