弓形蟲基因工程疫苗研究進展

趙海忠　李良華　宋忠旭　孫華　彭先文　梅書棋

摘要：弓形蟲病是嚴重危害人和動物健康的重要人畜共患病。疫苗接種是目前防控弓形蟲病的主要手段。根據國內外弓形蟲病研究的現狀，簡要介紹了弓形蟲基因結構、主要編碼蛋白和相關基因工程疫苗的最新研究進展，主要包括核酸疫苗、重組卡介苗、多肽疫苗、基因缺失苗等，最后對基因工程疫苗研究工作的繼續開展提出了建議。

關鍵詞：弓形蟲；基因；抗原蛋白；基因工程疫苗

中圖分類號：S852.7 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）04-0010-03

弓形蟲病（Toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma）所引起的人畜共患病。它廣泛寄生在人和動物的有核細胞內。該病呈全球性分布和流行，孕婦、寵物喂養者、飼養員、屠宰人員及免疫功能低下者均為高危人群。據估計，全世界約有25%的人受感染，我國人群感染率約為5%～20%[1]。弓形蟲在家畜中主要感染豬，以高熱、呼吸困難、神經癥狀以及繁殖障礙為特征。近年來，弓形蟲病在豬場發病率呈上升趨勢，死亡率高達60%，給養豬業造成了較大經濟損失[2]。因此，該病的防治工作十分重要，而疫苗免疫仍是預防該病的重要手段[3]。隨著近幾年對弓形蟲相關基因和抗原結構研究的不斷深入，弓形蟲基因工程疫苗的研發取得了重大進展。本文主要對弓形蟲基因結構與基因工程疫苗研究的最新進展進行闡述，以期為科研工作者更好地防治該病提供參考。

1 基因組結構

弓形蟲DNA以線粒體DNA、染色體DNA和類質共生體DNA三種形式存在。線粒體DNA為環形，長度為36 kb。有一段約10 kb的顛倒重復序列。它除了編碼與呼吸鏈相關蛋白外，還有可能參與編碼弓形蟲期轉換的有關物質[4]。染色體DNA中G+C含量約為55%，沒有甲基化的堿基[5]。類質共生體DNA也為環形，大小35 kb，是以其他真核生物類質體DNA序列為探針，通過原位雜交而發現的序列[6]。研究發現，類質共生體有綠藻原性，在漫長的進化過程中才逐漸演變成細胞器，它可能編碼DNA依賴的RNA聚合酶亞單位β和β′核糖體RNA小亞單位[7]。

2 主要編碼蛋白與基因工程疫苗

2.1 P30蛋白抗原

P30基因為單一拷貝基因，全長1 634 bp，不含有內含子。P30突變導致蟲體結合細胞能力顯著下降，在黏附宿主細胞膜過程中起著配體作用，在原核、真核和昆蟲細胞中均能表達出融合和非融合形式的重組蛋白[8]。P30表達產物的抗原活性與蛋白分子的折疊存在密切相關[9]，分子構象高度決定其抗原性。易艷軍[10]構建了弓形蟲P30基因的乳酸乳球菌表達質粒L2Ps-P30-T，并在乳酸乳球菌中表達P30基因，表達產物口服免疫小鼠，結果表明在體液免疫、黏膜免疫水平上誘導小鼠對弓形蟲感染具有保護力。魏慶寬等[11]擴增HBsAg目的基因片段，并將HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表達載體中，構建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表達載體，該載體包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列，為進一步研究多基因核酸疫苗奠定了基礎。

2.2 P22蛋白抗原

P22蛋白抗原是第2個被克隆和測序的弓形蟲表面抗原。速殖子入侵的過程由P22介導，錨定于有核細胞表面，并進入有核細胞內部[12]?？筆22蛋白抗體可以阻斷弓形蟲的再定位。P22蛋白除介導弓形蟲速殖子的入侵過程外，在弓形蟲速殖子向緩殖子轉化的過程中發揮作用。趙東岳等[13]將去掉信號肽和C-末端的基因片段插入原核表達載體pGEX-4T-3后轉化到大腸桿菌DH5α，采用誘導進行可溶性表達。重組蛋白具有良好的完全抗原活性，這也為弓形蟲的基因重組疫苗研究奠定了基礎。全娟花等[14]將弓形蟲SAG2基因插入pCMV-Taq2B載體，使其在真核細胞中高水平穩定表達，構建含pCMV-Taq2B-Surface antigen 2（表面膜抗原2）成分的核酸疫苗，結果表明，免疫組能產生特異性IgG抗體，末次免疫后28 d達到峰值。

2.3 P43蛋白抗原

P43蛋白抗原存在于弓形蟲所有入侵階段的膜蛋白。未成熟的P43蛋白由385個氨基酸殘基組成，含有一個N端信號肽和GPI。P43蛋白是參與弓形蟲入侵宿主細胞過程的主要分子，介導對宿主細胞的識別和黏附[15]。朱剛[16]以RH株弓形蟲P43蛋白為抗原分子，構建了重組質粒，并以兔抗P43蛋白血清檢測到該基因所表達蛋白具有免疫原性。對小鼠肌注后，檢測小鼠產生了細胞免疫和體液免疫應答，此DNA疫苗對小鼠感染弓形蟲具有一定的免疫保護。

2.4 P35蛋白抗原

張仁利等[17]成功地進行了弓形蟲P35蛋白的基因克隆，對P35蛋白進行分析，發現其C端區有高親水性區域在201～225和301～340氨基酸處，同時也發現其編碼的氨基酸序列含有多個T、B細胞的表位，P35蛋白可以產生部分的免疫保護力。易俊波等[18]則采用弓形蟲RH株表面抗原P35的cDNA序列設計一對引物，擴增出P35的基因片段，并將其克隆到T載體中。亞克隆至原核表達載體pET-KDO后，在大腸桿菌中經IPTG誘導表達，得到了具有良好抗原性的重組P35融合蛋白。

2.5 P23蛋白抗原

P23抗原為毒力相關抗原，位于速殖子表膜。該抗原僅見于RH株和BK株等強毒株，臨床分離的弱毒株未發現[19]。研究人員在研究弓形蟲疫苗的過程中發現了一種24 ku的多肽，該多肽能產生一定的免疫保護性，能阻止弓形蟲速殖子入侵宿主細胞。該多肽基因表達產物能在動物體內產生抗P23抗體，表明P23蛋白可能包含有該多肽的免疫表位。P23蛋白有望成為研發新型基因工程疫苗的重要抗原。

2.6 棒狀體蛋白

2.6.1 棒狀體蛋白1 棒狀體蛋白1基因是一個單拷貝基因，全長約為2.1 kb，蛋白分子質量約60.5 kDa，其N端為富含脯氨酸的酸性結構域，后面則是堿性羧基末端區域。用抗棒狀體蛋白1基因的單抗處理后，弓形蟲對宿主細胞的黏附受到抑制。棒狀體蛋白1基因盡管能誘導機體系統和黏膜局部體液免疫應答，但并不能產生明顯的免疫保護[20]。

2.6.2 棒狀體蛋白2 棒狀體蛋白2是弓形蟲棒狀體分泌的另一個重要蛋白，基因全長2 234 bp，不含內含子，未成熟的前體蛋白約66 kDa，成熟的棒狀體蛋白2約為54 kDa。該蛋白參與弓形蟲侵入后納蟲泡膜的形成，在弓形蟲生活史的速殖子期、緩殖子期以及子孢子期均有表達。研究發現棒狀體蛋白2的氨基端存在一系列的兩親性螺旋，單一的螺旋就能黏附于細胞膜上，共同作用則優先黏附于新形成的納蟲泡膜。肖婷等[21]構建了pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表達載體，然后轉染293T細胞并正確表達融合蛋白，該融合蛋白能被弓形蟲P30單抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清識別，具有免疫反應性，為乙肝和弓形蟲聯合疫苗的研制奠定了良好基礎。

2.7 微線體蛋白

2.7.1 微線體蛋白2（MIC2） 微線體蛋白2基因是單拷貝基因，有3個內含子，全長2 307 bp，編碼含769個氨基酸殘基，且698～718位氨基酸殘基間存在一個短的疏水信號肽，為典型的跨膜區。TgMIC2在蟲體的各期均有表達，TgMIC2和TgM2AP以1∶1的比例形成一個包含3個aB二聚體六聚體復合體。鄭斌等[22]采用定點突變技術，準確找到了MIC2與醛縮酶的作用位點為色氨酸（W）。而有關研究表明MIC2蛋白是弓形蟲感染的主要毒力因素，因而構建MIC2缺陷株是開發有效活弱毒疫苗的重要方法[23]。

2.7.2 微線體蛋白3（MIC3） 微線體蛋白3基因無內含子，ORF編碼一個富含半胱氨酸的395個氨基酸殘基多肽，N 端有一較短的疏水信號肽，無跨膜區域氨基酸序列中含5個表皮生長因子樣結構域，其中3個串聯排列，而另2個則與前3個有重疊，具有一個幾丁質連接樣結構域，這種序列能跟宿主蛋白一樣參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質的相互識別作用。MIC3在弓形蟲的各期都能表達，為該病診斷和疫苗研制非常有前景的候選分子[24]。唐菲等[25]原核表達了弓形蟲RH株MIC3重組蛋白，并檢測了該重組蛋白特異免疫反應性，這為利用該蛋白進行弓形蟲病診斷與疫苗研究奠定了基礎。

2.8 致密顆粒蛋白

2.8.1 致密顆粒蛋白1（GRA1） 致密顆粒蛋白1分子質量為23 kDa，含有2個鈣結合域，通過調節鈣離子濃度來穩定納蟲泡膜。劉慧穎等[26]通過構建致密顆粒蛋白GRA1基因真核重組表達質粒，在Hela細胞中表達GRA1蛋白。經檢測，GRA1蛋白具有良好的反應原性。構建的重組真核表達質粒制成的核酸疫苗，在小鼠攻毒試驗中表現出良好的免疫保護性，為該類疫苗的研發奠定了基礎。

2.8.2 致密顆粒蛋白2（GRA2） 致密顆粒蛋白2含一個長241 bp的內含子，長約1.3 kb，初級翻譯產物為一個185個氨基酸的多肽，含有23個氨基酸長的信號肽，富含絲氨酸和蘇氨酸。GRA2依賴3個兩性a螺旋，在弓形蟲侵入后起著誘導納蟲泡膜表面網絡結構形成的作用。研究人員利用重組蛋白和佐劑單磷酰脂質免疫小鼠后，能誘導產生高比例的IgG2a/IgG1特異性抗體，脾細胞體外經分泌-排泄抗原刺激后產生大量的IFN-γ和IL-2。攻毒試驗結果表明該重組蛋白能有效抵抗弓形蟲慢性感染[27]。

2.8.3 致密顆粒蛋白3（GRA3） 致密顆粒蛋白3分子質量為30 kDa，存在于內管網和納蟲泡膜。為單拷貝基因，其cDNA序列N端有2個起始密碼子，開放閱讀框含有一個22個氨基酸的疏水區和一個信號肽。沈繼龍等[28]研究表明，GRA3無有效的3D結構，抗原表位少，不宜作為弓形蟲有效疫苗候選分子。

3 展望

弓形蟲基因工程疫苗的研制方向：對弓形蟲與宿主之間的關系作深入研究，特別是針對弓形蟲各期所共有的保護性抗原及保護性表位的鑒定，繼續深入研究P30基因核酸疫苗、P22蛋白重組疫苗、P43蛋白重組疫苗、P23蛋白多肽疫苗、微線體蛋白2基因缺失苗等，在實用性、安全性及有效性方面顯示出強大的潛力。尋找更佳的免疫佐劑、優化免疫程序，提高基因工程疫苗的實用效果。

參考文獻：

[1] MEHLHORN H. Toxoplasma gondii[A].Encyclopedia of Parasitology[M].Berlin heidelberg：Springer，2015.

[2] 馮艷彬.豬弓形蟲病的流行病學、實驗室診斷與防治[J].現代畜牧科技，2018（11）：80.

[3] 張 越，王華琳，丁瑩瑩，等.我國人群和某些動物弓形蟲感染研究進展[J].動物醫學進展，2018，39（10）：96-101.

[4] 徐 婷，王 聰，羅慶禮，等.流行于我國的優勢基因型弓形蟲株毒力及其棒狀體蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差異分析[J].安徽醫科大學學報，2018（11）：1695-1699.

[5] COUTERMARSH-OTT S L，ALLEN I C，LINDSAY D S，et al. Caspase-11 modulates inflammation and attenuates Toxoplasma gondii pathogenesis[J].Mediators of inflammation，2016（9）：1-14.

[6] REIFF S B，VAISHNAVA S，STRIEPEN B. The HU protein is important for apicoplast genome maintenance and inheritance in Toxoplasma gondii[J].Eukaryot cell，2012，11（7）：905-915.

[7] CARMELO A A，ELENA S S. Checkpoints of apicomplexan cell division identified in Toxoplasma gondii[J].Plos pathogens，2017， 13（7）：e1006483.

[8] REZAEI A A，GOLCHIN M，NAKHAEI MOGHADAM M. Detection of Toxoplasma gondii in infected meat samples by a latex agglutination test using anti-P30 recombinant antibody[J].Comparative clinical pathology，2019，28（1）：29-32.

[9] ABDULLAH W O，UNYAH N Z，AWANG HAMAT R，et al. Determination of diagnostic value of Toxoplasma gondii recombinant surface antigen（SAG1，P30） in mouse experimental model[J].Malaysian journal of veterinary research，2014，5（1）：83-88.

[10] 易艷軍.弓形蟲P30蛋白在乳酸乳球菌中的表達及其誘導小鼠免疫應答的研究[D].湖南衡陽：南華大學，2013.

[11] 魏慶寬，王英婷，閆運琴，等.pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表達載體的構建與鑒定[J].中國血吸蟲病防治雜志，2014，26（1）：46-50.

[12] PERETTI L E，GONZALEZ VER？魷NICA D G，COSTA J G，et al. Synthesis and characterization of latex-protein complexes from different antigens of Toxoplasma gondii for immunoagglutination assays[J].International journal of polymeric materials and polymeric biomaterials，2016，65（18）：938-946.

[13] 趙東岳，陳金鋒，韋劍輝.弓形蟲截短SAG2基因的克隆表達與免疫活性分析[J].畜牧獸醫學報，2015，46（12）：2258-2263.

[14] 全娟花，李 鵬，喻才元，等.弓形蟲SAG2和GRA2基因疫苗的免疫保護研究[J].寄生蟲與醫學昆蟲學報，2014，21（4）：227-232.

[15] 何 成.弓形蟲感染宿主細胞磷酸化蛋白質組學分析及宿主細胞蛋白vimentin在弓形蟲感染過程中的作用機制研究[D].廣東廣州：南方醫科大學，2018.

[16] 朱 剛.弓形蟲pSMART2b-SAG3 DNA疫苗的研制及其初步應用[D].長春：吉林大學，2017.

[17] 張仁利，吳少庭，高世同，等.弓形蟲P35蛋白的基因克隆及其分子特征[J].中國人獸共患病雜志，2001，17（4）：24-26.

[18] 易俊波，王曉紅，買制剛，等.弓形蟲表面抗原P35基因片段的表達純化和抗原性分析[J].中國血吸蟲病防治雜志，2012，24（2）：178-182.

[19] GROSS U，BOHNE W，L？譈DER CARSTEN G K.，et al. Regulation of developmental differentiation in the protozoan parasite Toxoplasma gondii[J].Journal of eukaryotic microbiology，2010， 43（5）：114S-116S.

[20] NABI H，RASHID I，AHMAD N，et al. Induction of specific humoral immune response in mice immunized with ROP18 nanospheres from Toxoplasma gondii[J].Parasitology research，2016，116（1）：1-12.

[21] 肖 婷，毛德華，李 瑾，等.pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表達載體的構建及其在293T細胞中的表達[J].中國病原生物學雜志，2018，13（10）：1109-1112，1120.

[22] 鄭 斌，尹志奎，姚志軍，等. 剛地弓形蟲MIC2與醛縮酶作用位點的鑒定[J].中國人獸共患病學報，2014，30（7）：698-700.

[23] MY-HANG H，BING L，MAUD H，et al. Structural basis of Toxoplasma gondii MIC2-associated protein interaction with MIC2[J].Journal of biological chemistry，2015，290（3）：1432-1441.

[24] GU？魪RIN A，HAJJ H E，PENARETE-VARGAS D，et al. RON4L1 is a new member of the moving junction complex in Toxoplasma gondii[J].Scientific reports，2017，7（1）：17907.

[25] 唐 菲，韓思琪，吳 焜，等.弓形蟲RH株微線體蛋白MIC3的原核表達及其免疫反應性[J].中國熱帶醫學，2013，13（7）：786-789.

[26] 劉慧穎，孫 玲，李淑紅，等.弓形蟲GRA1基因核酸疫苗的實驗研究[J].中國病原生物學雜志，2012（3）：181-185.

[27] CAO A，LIU Y，WANG J，et al. Toxoplasma gondii：Vaccination with a DNA vaccine encoding T-and B-cell epitopes of SAG1，GRA2，GRA7 and ROP16 elicits protection against acute toxoplasmosis in mice.[J].Vaccine，2015，33（48）：6757-6762.

[28] 沈繼龍，陳 鶴，羅慶禮，等.基于生物信息學分析的弓形蟲GRA3的疫苗設計與體內驗證[A].中華醫學會2014全國微生物學與免疫學學術年會論文匯編[C].北京：中華醫學會、中華醫學會微生物學與免疫學分會，2014.