紫色紅曲霉固態發酵豆渣產紅曲色素的工藝研究

孔維寶，陳 冬，楊 洋，楊樹玲，張愛梅，牛世全

(1.西北師范大學 生命科學學院，蘭州 730070； 2.金徽酒股份有限公司，甘肅 隴南 742308)

豆渣是豆制品加工過程中的主要副產物，我國作為大豆生產大國、進口大國和消費大國，據測算每年產生2 000多萬t的濕豆渣，產量大、來源廣[1]。豆渣營養豐富，富含膳食纖維、蛋白質、鈣、磷、鐵、維生素等多種營養成分，是目前動物日糧中最常用的蛋白飼料，但高纖維含量以及多種抗營養因子的存在，導致豆渣不易被機體降解消化，使其利用率降低，且在加工過程中產生的豆腥味無法去除，最終導致豆渣的開發利用效果不佳[2-3]。研究表明，微生物發酵豆渣不僅能有效緩解這些不利因素，還可進一步提高其營養價值，是豆渣高效利用的有效途徑之一[4]。

紅曲霉(Monascus)為一種小型絲狀腐生真菌，其代謝過程中可產生紅曲色素、Monacolin類膽固醇合成抑制劑、抑菌性物質等多種生理活性物質，尤其是紅曲色素被視為安全性極高的天然食用色素，還可預防多種疾病，有望替代化學合成色素，在食品領域廣泛使用[5-6]。以紅曲霉進行固態發酵是獲取其代謝產物的主要途徑之一，目前固態發酵法生產紅曲色素主要以大米為原料進行發酵，但以大米為固態發酵基質生產紅曲色素的成本較高，在工業上很難實現大規模生產[7]。因此，從綠色環保和有效開發利用農業廢棄物的角度出發，將豆渣、豆粕、玉米、麥麩等一些廉價的農產品及其加工廢棄物用作固態發酵基質，用來發酵生產紅曲霉次級代謝產物及微生物飼料的研究具有重要的實際應用價值。已有的研究表明紅曲霉可利用多種農林廢棄物進行固態發酵生產生物活性物質[8]。基于此，本文主要探討了以紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)固態發酵豆渣產紅曲色素的可行性，對以豆渣為固態發酵基質產紅曲色素的工藝進行了優化，以期篩選出廉價高效的有機固態發酵基質和工藝參數，為紅曲霉固態發酵制劑(營養強化劑或功能飼料)的開發提供實驗依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與試劑

紫色紅曲霉(M.purpureus)菌株由作者所在實驗室從市售紅曲米中分離、鑒定并保藏。

無水乙醇、硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、甘油，均為分析純；紅曲紅標準品(上海源葉生物科技有限公司)。

1.1.2 儀器與設備

DHP-9080B改良恒溫恒濕培養箱(上海瑯玕實驗設備公司)，GI54TW高壓蒸汽滅菌鍋(致微儀器有限公司)，AC2-4S1生物安全柜(新加坡藝思高)，CP124C分析電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)，TG20-WS離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)，FCD-3000恒溫鼓風干燥箱(上海瑯玕實驗設備公司)，UV-2800紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)。

1.1.3 培養基

菌種保藏培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。

種子培養基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，自然pH。

固態發酵基質：分別以干燥的豆渣(大豆制品加工廢棄物)、大米、大豆粉、去皮大豆粉和小麥麩皮為發酵基質，各稱取20 g后加一定量的蒸餾水混勻調節初始含水量，121℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵種子液的制備

取4℃冰箱保存的M.purpureus接種于PDA斜面培養基，30℃活化培養5～7 d，向活化后的PDA斜面培養基中加入5 mL無菌水，輕輕刮下孢子，制成孢子懸浮液。吸取2 mL孢子懸浮液接種于含有100 mL種子培養基的250 mL錐形瓶中，于200 r/min、30℃恒溫振蕩培養箱中培養2 d。

1.2.2 發酵培養

向固態發酵培養基中接入一定量發酵種子液，控制溫度30℃、濕度60%～65%的條件下發酵培養。

1.2.3 紅曲色素的測定

標準曲線制作：精密稱取10 mg紅曲紅標準品，用70%乙醇溶解定容至100 mL，配制成質量濃度為0.1 mg/mL紅曲紅溶液。精密吸取1、2、3、4、5、6 mL至10 mL容量瓶中，70%乙醇定容至刻度，得到10、20、30、40、50、60 μg/mL的紅曲紅標準溶液。70%乙醇作空白，分別測定各質量濃度溶液在505 nm處的吸光值，并以質量濃度(y)為縱坐標，505 nm處的吸光值(A)為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=0.097A+0.002 1，R2=0.998 53。

紅曲色素測定：將發酵后的固態基質冷凍干燥后粉碎，稱取1.00 g樣品加入10 mL 70%乙醇，60℃水浴提取2 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清液；沉淀物在相同條件下重復提取2次，合并上清液，定容、稀釋后測定505 nm處的吸光值。按照標準曲線方程計算紅曲色素含量。

1.2.4 數據統計與分析

采用Origin 9進行數據統計，SPSS 22和Latin.lnk正交設計助手用于數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同固態發酵基質對M. purpureus產紅曲色素的影響

不同固態發酵基質大米、去皮大豆粉、大豆粉、豆渣和小麥麩皮分別加入10、15、20 mL水調整基質初始含水量分別為33.33%、42.86%、50%，按10%的接種量接入發酵種子液，按1.2.2發酵培養14 d后，測定發酵固體樣品中的紅曲色素含量，探究不同固態發酵基質對M.purpureus產紅曲色素的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同固態發酵基質對紅曲色素含量的影響

由圖1可知，固態發酵基質初始含水量低，不利于紅曲色素的產生，整體來看，在基質初始含水量50%的條件下產紅曲色素的效果相對較好。原因在于固態發酵中幾乎沒有游離水，微生物生長所需水分主要依賴于基質初始含水量，較低的基質初始含水量加上后期的蒸發，導致基質較干，不足以滿足微生物大量生長繁殖對水分的需求，從而抑制了紫色紅曲霉的生長[9]。整體來看，大米和豆渣發酵基質產紅曲色素的效果最好，且兩者差距不大，遠高于去皮大豆粉、大豆粉和小麥麩皮產紅曲色素的量。由于大米主要成分為淀粉，被紅曲淀粉酶降解為葡萄糖加以利用，為紫色紅曲霉的生長提供了豐富的碳源，此外大米發酵基質保濕效果也相對較好，利于色素的積累[10-11]。而大豆的蛋白質、脂肪、膳食纖維含量較高，為紫色紅曲霉的生長提供了豐富的碳、氮源。豆渣是大豆經物理壓榨或高溫處理得來的，加工過程中更容易使一些不溶性膳食纖維大分子轉變為小分子低聚體的膳食纖維降解物，被微生物利用，同時豆渣顆粒度大于大豆粉，不易粘連成塊，增加了CO2和O2的通透性，不僅促進了紫色紅曲霉生長，還增加了紅曲色素的積累[12]。通過比較去皮大豆粉和大豆粉的紅曲色素的量可以推測，大豆皮中可能存在某種物質能夠促進紫色紅曲霉發酵產紅曲色素，也可能由于大豆皮的存在增大了發酵基質間的孔隙，增加了通氣性。基于發酵基質廉價且能高產紅曲色素的目標，本文選取豆渣做進一步的優化實驗。

2.2 不同營養因子對M.purpureus固態發酵豆渣產紅曲色素影響的單因素實驗

2.2.1 甘油添加量的影響

甘油作為能被紅曲霉快速利用的常用碳源之一，不僅價格低廉容易獲得，還可使菌體生長過程完成后仍保持碳代謝的饑餓狀態，促進紅曲色素的大量積累[13-14]。以豆渣為固態發酵基質，在接種量10%、豆渣加水量15 mL的條件下，按1.2.2發酵培養14 d，考察不同甘油添加量(1%、3%、5%、7%、9%)對M.purpureus產紅曲色素的影響，結果如圖2所示。

圖2 甘油添加量對紅曲色素含量的影響

由圖2可知，甘油添加量在1%～5%時，紅曲色素含量呈現急速上升趨勢，甘油添加量為5%～7%時，紅曲色素含量緩慢上升，當甘油添加量在7%～9%時，紅曲色素含量出現下降趨勢，且甘油添加量為7%時紅曲色素含量達到最大值。該現象可能是由于低濃度的甘油作為碳源促進了紫色紅曲霉生物量的積累，逐漸提高紅曲色素含量。當甘油添加量大于7%時，碳源積累過多降低了發酵底物的pH，抑制產物積累[15]。

2.2.2 NaNO3添加量的影響

NaNO3是促進紅曲霉產紅曲色素的最佳氮源之一。以豆渣為固態發酵基質，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發酵培養14 d，考察不同NaNO3添加量(0.01%、0.04%、0.07%、0.10%、0.13%、0.16%)對M.purpureus發酵產紅曲色素的影響，結果如圖3所示。

圖3 NaNO3添加量對紅曲色素含量的影響

由圖3可知，NaNO3添加量在0.01%～0.04%時，紅曲色素含量呈現上升的趨勢，NaNO3添加量在0.04%～0.16%時，紅曲色素含量逐漸降低，且豆渣中NaNO3添加量為0.04%時紅曲色素含量達到最大值。NaNO3為紫色紅曲霉的生長繁殖提供氮源，在低濃度NaNO3的添加范圍內，氮源被紫色紅曲霉充分利用，增加生物量的同時提升了紅曲色素含量。當NaNO3添加量達到飽和后，不再被紫色紅曲霉利用，此時高濃度的NaNO3抑制了紫色紅曲霉的生長代謝[16]。

2.2.3 KH2PO4添加量的影響

以豆渣為固態發酵基質，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發酵培養14 d，考察不同KH2PO4添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對M.purpureus發酵產紅曲色素的影響，結果如圖4所示。

圖4 KH2PO4添加量對紅曲色素含量的影響

由圖4可知，KH2PO4添加量在0.1%～0.2%內，紅曲色素含量緩慢上升，在0.2%～0.4%的范圍內，紅曲色素含量迅速增加，KH2PO4添加量在0.4%～0.5%時，紅曲色素含量呈現下降趨勢，且KH2PO4添加量為0.4%時紅曲色素含量達到最大值。無機鹽濃度可以顯著影響菌體細胞的生長和紅曲色素的形成，因此低濃度的無機鹽有益于紫色紅曲霉的生理活動，而當濃度過高時主要表現為抑制等負面效應，該結果與周建建等[17]結果趨勢相似。

2.2.4 MgSO4添加量的影響

以豆渣為固態發酵基質，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發酵培養14 d，考察不同的MgSO4添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對M.purpureus發酵產紅曲色素的影響，結果如圖5所示。

圖5 MgSO4添加量對紅曲色素含量的影響

由圖5可知，MgSO4添加量在0.1%～0.2%內，紅曲色素含量逐漸上升，在0.2%～0.4%的范圍內，紅曲色素含量急速下降，在0.4%～0.5%時，紅曲色素含量呈現平穩狀態，MgSO4添加量為0.2%時紅曲色素含量達到最大值，此時MgSO4促進了紫色紅曲霉的生理活動和紅曲色素的產生，當添加量大于0.2%時，濃度過高則抑制了紫色紅曲霉的生長。

2.2.5 抗壞血酸添加量的影響

抗壞血酸能夠在一定程度上提高紅曲色素的穩定性，同時還能促進紅曲霉的生長和色素的產生[18]。以豆渣為固態發酵基質，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發酵培養14 d，考察不同的抗壞血酸添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)對M.purpureus產紅曲色素的影響，結果如圖6所示。

圖6 抗壞血酸添加量對紅曲色素含量的影響

由圖6可知，抗壞血酸添加量在0.5%～1.5%的范圍內，紅曲色素含量緩慢上升，在1.5%～2%內，紅曲色素含量急速上升，當抗壞血酸添加量由2%逐漸增加到2.5%時，紅曲色素含量呈下降趨勢，且在抗壞血酸添加量為2%時，紅曲色素含量達到最大值。由于紫色紅曲霉產紅曲色素的最佳條件為中性偏酸，而少量抗壞血酸的添加使發酵環境逐漸偏酸性，利于紅曲色素的積累，當抗壞血酸添加量超過2%時過酸的發酵環境開始抑制紫色紅曲霉的生長[19]。

2.3 不同發酵條件對M. purpureus固態發酵豆渣產紅曲色素影響的單因素實驗

2.3.1 基質初始含水量的影響

在豆渣中加入蒸餾水，得到不同初始含水量(30%、40%、50%、60%和70%)的基質，在接種量10%條件下，按1.2.2發酵培養14 d，考察初始含水量對發酵的影響，結果如圖7所示。

圖7 基質初始含水量對紅曲色素含量的影響

由圖7可知，當初始含水量從30%增加到50%時，紅曲色素含量逐漸上升，當初始含水量從50%增加到60%時，紅曲色素含量急速下降，初始含水量從60%增加到70%時，紅曲色素含量緩慢降低后趨于平穩。初始含水量在50%時，紅曲色素含量達到最大值。造成上述現象的主要原因是初始含水量低使得紫色紅曲霉生長受到抑制，到發酵后期，由于微生物對水分的消耗及蒸發損失造成物料較干，抑制微生物生長。當含水量過高時，減少了基質內氣體的交換，不利于微生物生長[20]。鄭虹等[7]以大米和玉米的混合物為固態發酵基質，含水量約為57%時紅曲色素含量較高；王金字等[9]以糯米為固態發酵基質，在初始含水量為50%時紅曲色素含量最高；Babitha等[21]以菠蘿蜜種子粉為基質，50%的含水量條件下產色素效果較好。可以看出，初始含水量在50%左右時，紫色紅曲霉固態發酵產紅曲色素效果較好。

2.3.2 接種量的影響

接種量的多少會影響到整個發酵的效果，一般要求適量。通常采用大的接種量可以縮短菌體繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會，但接種量過大也會導致單位體積內養料和溶氧不足，干擾菌體繁殖代謝[16]。在豆渣中加入15 mL蒸餾水，設置不同接種量(2%、4%、6%、8%、10%)，按1.2.2發酵培養14 d，考察接種量對發酵的影響，結果如圖8所示。

圖8 接種量對紅曲色素含量的影響

由圖8可知，當接種量從2%增加到8%時，紅曲色素含量呈現先緩慢上升，后急速上升的趨勢。當接種量大于8%時，紅曲色素含量呈現下降趨勢，從而確定豆渣培養基產紅曲色素的最佳接種量為8%。

2.3.3 發酵時間的影響

在豆渣中加入15 mL蒸餾水、接種量10%條件下，按1.2.2分別發酵培養6、8、10、12、14 d，考察發酵時間對發酵的影響，結果如圖9所示。

由圖9可知，發酵時間從6 d逐漸增加到12 d時，紅曲色素含量也隨之增加，且在發酵時間為12 d時，紅曲色素含量達到最大值。微生物發酵都有一個最佳時間，發酵時間過短，不利于目標產物(紅曲色素)的積累，發酵時間過長，由于營養物質的消耗及多種代謝產物的積累導致環境不利于菌體生長，導致紅曲色素含量下降[22]。

圖9 發酵時間對紅曲色素含量的影響

2.4 正交實驗優化

結合單因素實驗結果，固定豆渣初始含水量50%、接種量8%、發酵時間12 d，以甘油添加量(A)、NaNO3添加量(B)、KH2PO4添加量(C)、MgSO4添加量(D)和抗壞血酸添加量(E)為考察因素，以紅曲色素含量為響應值，采用Latin.lnk正交設計助手設計L16(45)的五因素四水平正交實驗，正交實驗因素水平見表1，正交實驗設計及結果見表2。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗設計及結果

由表2可知，5個因素對M.purpureus固態發酵豆渣產紅曲色素的影響程度大小順序為抗壞血酸添加量>甘油添加量>KH2PO4添加量>NaNO3添加量>MgSO4添加量。固態發酵產紅曲色素的最優固態發酵培養基組合為A2B2C1D2E3，即：甘油6%，NaNO30.04%，KH2PO40.3%，MgSO40.2%，抗壞血酸2.2%。在優化的培養基組合下進行3次驗證實驗，紅曲色素含量可達(6.03±0.11)mg/g。

3 結 論

(1)從大米、去皮大豆粉、大豆粉、豆渣和小麥麩皮5種固體基質中篩選出廉價的大豆制品加工副產物——豆渣作為適宜生產紅曲色素的固態發酵基質。

(2)采用單因素實驗和正交實驗，確定以紫色紅曲霉固態發酵豆渣產紅曲色素的優化培養基組成為豆渣初始含水量50%，添加甘油6%、NaNO30.04%、KH2PO40.3%、MgSO40.2%、抗壞血酸2.2%；最佳培養條件為控制濕度60%～65%、接種量8%、30℃發酵12 d。在最佳條件下，發酵豆渣中紅曲色素含量可達(6.03±0.11)mg/g。

(3)以豆渣為主要原料固態發酵生產紅曲色素具有良好的可行性和經濟性。一方面經紫色紅曲霉發酵的豆渣可作為提取生產紅曲色素的原料，另一方面富含生物活性物質的紅曲豆渣可直接作為功能性生物飼料或紅曲制劑，可顯著提高豆渣的利用度和附加值。