響應(yīng)面法優(yōu)化核桃油復(fù)合抗氧化劑的研究

盧付青，游敬剛，潘紅梅，吳 斌，唐蜀智，李益恩，黃 靜，鄧 楷，羅 丹

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，成都 611130； 2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，成都 610081；3.綿陽德生皇食品有限責(zé)任公司，四川 綿陽 621000)

核桃油含有高達(dá)90%左右的不飽和脂肪酸，有利于降低人體膽固醇和防止動脈硬化，其含有的亞油酸是人體必需脂肪酸，具有多種保健功能。然而，由于核桃油富含不飽和脂肪酸，其在加工儲存過程中易發(fā)生氧化酸敗，嚴(yán)重影響其食用品質(zhì)，并降低儲存期。

抗氧化劑廣泛用于油脂行業(yè)以延長油脂保質(zhì)期。李書國等[1]研究發(fā)現(xiàn)特丁基對苯二酚(TBHQ)、沒食子酸丙酯(PG)、2,6-二叔丁基對甲苯酚(BHT)均可不同程度地延長核桃油的貨架期。牛艷等[2]研究發(fā)現(xiàn)，空氣、水分和光照等因素對亞麻籽油的過氧化值產(chǎn)生較大影響，而抑制亞麻籽油氧化最常用的方法是添加抗氧化劑。陳杰等[3]利用Schaal烘箱法研究抗氧化劑對亞麻籽油貨架期的影響，得出TBHQ可延長亞麻籽油貨架期12個月。采用響應(yīng)面分析法篩選核桃油最優(yōu)復(fù)配抗氧化劑和增效劑的研究尚未見報道。本文主要以抗氧化劑TBHQ、丁基羥基茴香醚(BHA)和BHT及增效劑檸檬酸、抗壞血酸為研究對象，通過單一和復(fù)配試驗、響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以過氧化值為評價指標(biāo)，篩選出核桃油最優(yōu)抗氧化劑，以期為工業(yè)化生產(chǎn)中延長核桃油貨架期提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核桃油,綿陽德生皇食品有限責(zé)任公司；TBHQ、BHT、BHA、檸檬酸、抗壞血酸(食品級)均為市售。

冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、石油醚(沸程30～60℃)、可溶性淀粉均為分析純；重鉻酸鉀為工作基準(zhǔn)試劑,成都科龍化學(xué)試劑廠。

FA2004N電子天平，DHG-9240智能型恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 加速氧化試驗

采用Schaal烘箱法[4-5]。將核桃油樣品盛放于廣口瓶中，在60℃恒溫烘箱中加熱以加速氧化，每隔24 h測其過氧化值，直至超過核桃油國標(biāo)(GB/T 22327—2008)限值6 mmol/kg。

1.2.2 單一和復(fù)合抗氧化劑試驗

將0.02%TBHQ、0.02%BHT、0.02%BHA和總量不超過0.02%TBHQ、BHT、BHA任意組合，分別加入200 g核桃油中溶解，以未添加抗氧化劑的油樣作空白對照，按1.2.1方法進(jìn)行加速氧化試驗，研究單一和復(fù)合抗氧化劑對核桃油的抗氧化效果，以篩選最優(yōu)抗氧化劑。

1.2.3 最優(yōu)抗氧化劑與增效劑復(fù)配試驗

將1.2.2篩選的最優(yōu)復(fù)合抗氧化劑分別與檸檬酸、抗壞血酸復(fù)配使用，以未添加增效劑的油樣為對照，按1.2.1方法進(jìn)行加速氧化試驗。研究復(fù)合抗氧化劑與增效劑復(fù)配對核桃油的抗氧化效果。

1.2.4 過氧化值測定

按照GB 5009.227—2016中第一法(滴定法)進(jìn)行測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，測定結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用Excel，Design-Expert 8.0.7和SPSS21.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一和復(fù)合抗氧化劑試驗

2.1.1 單一抗氧化劑試驗(見圖1)

圖1 單一抗氧化劑對核桃油過氧化值的影響

由圖1可知，隨加熱時間的延長，核桃油過氧化值均逐漸升高，3種抗氧化劑對核桃油的抗氧化效果不同。空白對照的過氧化值變化較明顯，在24 h時即超過壓榨核桃油國標(biāo)限值6 mmol/kg。添加抗氧化劑的核桃油過氧化值上升趨勢有所減緩，其中添加0.02% TBHQ的核桃油在60℃恒溫加熱96 h才超過6 mmol/kg，添加0.02% BHT、0.02% BHA的核桃油均在48 h達(dá)到6 mmol/kg。3種抗氧化劑抗氧化效果強弱依次為TBHQ>BHT>BHA。

TBHQ與維生素E類似，均供氫形成穩(wěn)定自由基，從而終止自由基鏈反應(yīng)。BHA和BHT等酚型抗氧化劑可與油脂氧化產(chǎn)生的過氧化物結(jié)合，中斷自動氧化反應(yīng)鏈，阻止氧化[6]。

2.1.2 復(fù)合抗氧化劑試驗(見圖2)

圖2 復(fù)合抗氧化劑對核桃油過氧化值的影響

對食用油而言，單一的抗氧化劑可能難以達(dá)到最佳抗氧化效果，復(fù)合使用抗氧化劑可提高食用油氧化穩(wěn)定性。由圖2可知，在復(fù)合抗氧化劑總量不超過0.02%條件下，核桃油過氧化值隨著加熱時間的延長均逐漸升高。空白對照的過氧化值在24 h時已超過6 mmol/kg，變化顯著。添加不同復(fù)合抗氧化劑的過氧化值顯著低于空白對照的，其中添加0.01%TBHQ+0.01%BHT的核桃油超過192 h過氧化值才高于6 mmol/kg。與圖1相比，復(fù)合抗氧化劑的效果優(yōu)于單一抗氧化劑，這是因為各種抗氧化劑在發(fā)揮協(xié)同抗氧化作用時，產(chǎn)生的游離基也會生成新的酚類化合物，繼續(xù)發(fā)揮抗氧化作用，從而增強其抗氧化性[7-8]。

通過單一和復(fù)合抗氧化劑的抗氧化加速試驗，選擇復(fù)合抗氧化劑0.01%TBHQ+0.01%BHT作為最優(yōu)抗氧化劑，與增效劑進(jìn)行復(fù)配試驗。

2.2 最優(yōu)抗氧化劑與增效劑復(fù)配(見圖3、圖4)

圖3 復(fù)合抗氧化劑與檸檬酸復(fù)配對核桃油 過氧化值的影響

圖4 復(fù)合抗氧化劑與抗壞血酸復(fù)配對核桃油 過氧化值的影響

常用的增效劑有檸檬酸、抗壞血酸、異抗壞血酸、植酸、磷酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等。由圖3和圖4可知，隨著加熱時間的延長，添加不同量檸檬酸、抗壞血酸的核桃油過氧化值均逐漸升高。空白對照的過氧化值在192 h時超過6 mmol/kg，而添加檸檬酸、抗壞血酸的核桃油過氧化值達(dá)到6 mmol/kg的加熱時間有不同程度的延長。其中添加0.010%檸檬酸的核桃油在312 h超過6 mmol/kg，添加0.010%和0.012%抗壞血酸的核桃油過氧化值差異不明顯，超過288 h達(dá)到6 mmol/kg。

核桃油中的Cu2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+等金屬離子能催化油脂氧化，縮短氧化誘導(dǎo)期，提高過氧化物的分解速度和自由基的產(chǎn)生速度，并使抗氧化劑迅速發(fā)生氧化而失去作用。而加入的檸檬酸、 抗壞血酸等絡(luò)合了這些金屬離子，使抗氧化劑抗氧化活性再生，從而發(fā)揮其抗氧化增效作用，延長油脂的儲藏期[8]。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗回歸模型及優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以復(fù)合抗氧化劑(TBHQ與BHT質(zhì)量比1∶1)、檸檬酸、抗壞血酸加量為自變量，以過氧化值(Y)為響應(yīng)值，采用三因素三水平進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，建立用于分析和預(yù)測核桃油抗氧化劑的數(shù)學(xué)模型。響應(yīng)面試驗因素水平見表1， 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果

注：核桃油在60℃烘箱加熱120 h后測定的過氧化值。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.7軟件對表2試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，可得到過氧化值(Y)與各因素之間的二次多項模型：Y=4.14-0.64A-0.32B-0.13C+0.27A2+0.023B2-0.056C2+5.882E-003AB-0.049AC-0.12BC。對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，對產(chǎn)品過氧化值(Y)的影響大小依次為A>B>A2>C>BC>C2>AC>B2>AB，其中A、B、C、A2和BC影響極顯著(P<0.01)，AC和C2影響顯著(P<0.05)，而AB、B2影響不顯著(P>0.05)。該回歸模型P小于0.000 1，表明該方程模型極顯著；模型失擬項不顯著(P=0.138 3>0.05)，即該方程擬合較好；模型相關(guān)系數(shù)R2為0.998 0，大于0.9，說明模型高度相關(guān)；信噪比RSN為68.624，大于4，說明模型設(shè)計合理，可用于預(yù)測。

2.3.2 最適條件及驗證試驗

對Design-Expert分析得到的優(yōu)化回歸方程求解極小值，結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合抗氧化劑、檸檬酸、抗壞血酸加量分別為0.017%、0.012%、0.010%時，核桃油在60℃烘箱加熱120 h的過氧化值為3.40 mmol/kg。為驗證方案的有效性，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，平均過氧化值為3.45 mmol/kg，實際值與預(yù)測值基本相近，在模型誤差允許范圍內(nèi)，采用響應(yīng)面Box-Behnken優(yōu)化獲得的核桃油抗氧化劑保鮮方案準(zhǔn)確可靠，對工業(yè)化生產(chǎn)具有實際的指導(dǎo)意義。

2.4 核桃油貨架期的預(yù)測

對添加最優(yōu)復(fù)合抗氧化劑和增效劑的核桃油進(jìn)行60℃烘箱儲存試驗，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨加熱時間延長，空白樣品的過氧化值迅速增加，而添加最優(yōu)組合的抗氧化劑和增效劑的核桃油儲藏期由24～48 h延長到432 h。根據(jù)阿侖尼烏斯(Arrhenius)公式得出的油脂儲存溫度與其貨架期之間的關(guān)系，Schaal烘箱法試驗60℃條件下儲存1 d相當(dāng)于20℃條件下貯藏16 d[9-10]。因此，該核桃油在20℃條件下的理論貨架期為288 d。

圖5 最優(yōu)復(fù)合抗氧化劑和增效劑對核桃油過氧化值的影響

3 結(jié) 論

添加抗氧化劑可顯著增強核桃油的穩(wěn)定性，復(fù)合抗氧化劑抗氧化效果明顯優(yōu)于單一抗氧化劑，復(fù)合抗氧化劑0.01%TBHQ+0.01%BHT的抗氧化效果最好；檸檬酸和抗壞血酸對抗氧化劑均有增效作用，檸檬酸的作用更強；0.017%復(fù)合抗氧化劑(TBHQ與BHT質(zhì)量比1∶1)、0.012%檸檬酸和0.010%抗壞血酸的組合抗氧化效果最好，核桃油在20℃下的理論貨架期為288 d。