魚油中EPA和DHA的酶法富集工藝研究

王國財，劉菊妍，蘇薇薇，黃建軍，許文東，唐順之，關偉鍵，熊淑嫻

(1.中山大學 生命科學學院，廣州 510006； 2.廣州白云山漢方現代藥業有限公司 中藥提取分離過程現代化國家工程研究中心，廣州 510006； 3.廣州醫藥集團有限公司，廣州 510006)

魚油是一種從魚類中提取精煉而成的油脂，富含ω-3脂肪酸[1]。ω-3脂肪酸中的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)是魚油的主要功效成分，不僅是構成腦膜脂質的主要成分，而且還具有調節血脂、降低血液黏稠度、健腦益智、改善和增加記憶、增強人體免疫功能、抑制炎癥及改善視力等功效[1-5]。由注射用精制魚油為原料制備的ω-3魚油脂肪乳注射液可以快速增加細胞膜ω-3脂肪酸含量，臨床上發揮抗炎和免疫調節作用，降低并發癥，并且對于危重癥病人，能顯著降低病死率，減少抗生素用量，縮短住院時間[6-7]。

天然來源的魚油主要成分為甘油三酯，幾乎不含甘油二酯、甘油一酯，不存在脂肪酸乙酯等人工合成的成分。據報道，魚油甘油三酯中Sn-1位主要為飽和脂肪酸[8]，而Sn-1,3特異性脂肪酶水解短鏈脂肪酸酯鍵的速率比水解長鏈脂肪酸酯鍵要快，因此可以利用該酶水解速率的差異，將1,3位含飽和脂肪酸的甘油三酯水解成甘油二酯、甘油一酯等[9-10]。而且偏甘油酯脂肪酶能夠將甘油二酯、甘油一酯轉化為脂肪酸[10-11]，并參照經典方法進行堿煉脫酸[8]，從而提高魚油中EPA和DHA的含量，同時保持精制魚油的天然屬性。

目前國內外關于精制魚油制備工藝更多的是關于食品級精制魚油的工藝報道[11-14]。目前為了提高EPA和DHA含量，制備食品級精制魚油的方法主要包括酶法和化學法，精制得到的魚油均為合成的魚油，沒有很好地控制脂肪酸乙酯、甘油二酯、甘油一酯等雜質。本文先利用固定化Sn-1,3特異性脂肪酶水解魚油中1,3位含飽和脂肪酸的甘油三酯，再利用偏甘油酯脂肪酶將水解產生的甘油二酯、甘油一酯轉化為脂肪酸[10]，最后參照經典方法進行堿煉脫酸[8]，從而精煉得到高含量EPA和DHA的保持天然屬性的精制魚油。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

食品級魚油(舟山新諾佳生物工程有限責任公司)；EPA甲酯(標準品，批號62390099，上海安譜實驗科技股份有限公司)；DHA甲酯(標準品，批號62380079，上海安譜實驗科技股份有限公司)；固定化Sn-1,3特異性脂肪酶(TLIM，日本天野酶制品株式會社)；偏甘油酯脂肪酶(Lipase G50，日本天野酶制品株式會社)；純化水(自制)；三氯甲烷、甲醇、三氟化硼、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉等，均為分析純。

DF-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；GC-7890N氣相色譜儀(美國安捷倫公司)；LXJ-IIB離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPA和DHA富集工藝

取100.0 g食品級魚油，加入一定量的固定化Sn-1,3特異性脂肪酶(以下簡稱脂肪酶)，加入一定量的純化水，在一定溫度、時間、pH 6條件下攪拌水解，離心去除固定化Sn-1,3特異性脂肪酶與水，得到部分水解的甘油酯混合物。向甘油酯混合物加入5.0 g偏甘油酯脂肪酶、2.0 g純化水，30℃、pH 6條件下攪拌水解3 h，離心去除偏甘油酯脂肪酶與水，堿煉脫酸[8]，得到富含EPA、DHA的產品。按下式計算產品收率。

收率=A/100×100%

式中：A為富含EPA和DHA的產品質量，g。

1.2.2 魚油脂肪酸組成分析

取約0.1 g的魚油樣品置于10 mL容量瓶中，加含50 mg/L BHT的異辛烷溶液溶解并定容，得到樣品儲備液。取該儲備液2 mL，置于20 mL具塞石英玻璃管中，加入1.5 mL 20 mg/mL的氫氧化鈉甲醇溶液，充滿氮氣后蓋緊塞子，于65℃水浴加熱7 min，待冷卻后，加入2 mL三氟化硼甲醇溶液，充滿氮氣后蓋緊塞子，并置于65℃水浴30 min。取出，冷卻至40～50℃，加入1 mL異辛烷并充分搖晃30 s，并立即加入5 mL飽和氯化鈉溶液，充滿氮氣后搖晃至少15 s，靜置分層。取上層溶液，下層溶液再用1 mL異辛烷洗滌并收集合并上層液。用純化水洗滌上層液2次，每次1 mL，異辛烷層用無水硫酸鈉干燥后，取上清液，用微孔濾膜過濾，進GC分析。

氣相色譜條件：J & W122-7032毛細管脂肪酸分析柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；初始柱溫170℃，保持2 min，以3℃/min的速度升溫至240℃，保持15 min；進樣口溫度250℃；檢測器溫度270℃；氮氣流速1.2 mL/min；氫氣流速30 mL/min；空氣流速300 mL/min；進樣量2 μL。

2 結果與分析

2.1 EPA和DHA富集單因素實驗

2.1.1 脂肪酶用量對EPA和DHA總量及產品收率的影響

在純化水加入量4%、水解時間3 h、水解溫度40℃的條件下，考察脂肪酶用量對EPA和DHA總量及產品收率的影響，結果見圖1。

圖1 脂肪酶用量對EPA和DHA總量和產品收率的影響

由圖1可看出，隨著脂肪酶用量的增加，EPA和DHA總量呈現逐漸增加的趨勢，但產品收率逐漸減少。綜合考慮，脂肪酶用量選擇1%～15%的使用范圍。

2.1.2 純化水加入量對EPA和DHA總量及產品收率的影響

在脂肪酶用量10%、水解時間3 h、水解溫度40℃的條件下，考察純化水加入量對EPA和DHA總量及產品收率的影響，結果見圖2。

圖2 純化水加入量對EPA和DHA總量和產品收率的影響

由圖2可看出，隨著純化水加入量的增加，EPA和DHA總量呈現增加趨勢，到了8%后趨于平緩，產品收率則呈現減少的趨勢。從效益及環保考慮，選擇純化水加入量1%～10%的使用范圍。

2.1.3 水解時間對EPA和DHA總量及產品收率的影響

在脂肪酶用量10%、純化水加入量4%、水解溫度40℃的條件下，考察水解時間對EPA和DHA總量及產品收率的影響，結果見圖3。

圖3 水解時間對EPA和DHA總量和產品收率的影響

由圖3可看出，隨水解時間的延長，EPA和DHA總量呈現增加的趨勢，到了6 h后趨于平緩；產品收率呈現下降的趨勢，到了6 h后趨于平緩。從效益考慮，水解時間選擇范圍為2～6 h。

2.1.4 水解溫度對EPA和DHA總量及產品收率的影響

在脂肪酶用量10%、純化水加入量4%、水解時間3 h的條件下，考察水解溫度對EPA和DHA總量及產品收率的影響，結果見圖4。

圖4 水解溫度對EPA和DHA總量和產品收率的影響

由圖4可看出，隨著水解溫度的升高，EPA和DHA總量呈現增加的趨勢，在60℃后趨于穩定，產品收率呈現下降的趨勢，在60℃后趨于穩定。從效益考慮，水解溫度范圍為30～70℃。

由上述實驗結果可以看到，影響EPA和DHA富集的主要因素是脂肪酶用量和純化水加入量。從效率與經濟效益出發，富集EPA和DHA優化工藝條件為脂肪酶用量1%～15%、純化水加入量1%～10%、水解時間2～6 h、水解溫度30～70℃，在此條件下EPA和DHA總量為40%～60%，產品收率為48%～75%。

2.2 魚油脂肪酸組成

食品級魚油在脂肪酶用量10%、純化水加入量4%、水解溫度40℃、pH 6條件下攪拌水解3 h，采用偏甘油酯脂肪酶除去甘油二酯、甘油一酯，再經堿煉脫酸得到精制魚油，經甲酯化處理，采用GC對其脂肪酸組成進行分析，通過標準品對照和數據庫檢索，并按照面積歸一化法進行定量分析，結果見表1。

表1 食品級魚油與精制魚油脂肪酸組成%

脂肪酸食品級魚油精制魚油脂肪酸食品級魚油精制魚油豆蔻酸6.65.0C20∶1n-91.40.9棕櫚酸15.98.1C20∶1n-70.20.1棕櫚烯酸8.76.2花生四烯酸1.31.3C16∶4n-12.22.1C20∶4n-30.81.0硬脂酸3.71.0二十碳五烯酸(EPA)18.029.3油酸9.35.4C22∶1n-111.90.6C18∶1n-73.22.4C21∶5n-30.80.8亞油酸1.51.3C22∶5n-60.60.4亞麻酸1.21.3二十二碳五烯酸(DPA)1.82.2十八碳四烯酸2.44.5二十二碳六烯酸(DHA)13.526.3花生酸0.40.3

由表1可知，精制魚油中存在21種主要脂肪酸，食品級魚油經過富集之后，其飽和程度較高的脂肪酸含量降低，豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、硬脂酸、油酸含量分別從6.6%、15.9%、8.7%、3.7%、9.3%降至5.0%、8.1%、6.2%、1.0%、5.4%，而多不飽和脂肪酸含量得到富集，EPA含量從18.0%富集至29.3%，DHA含量從13.5%升高至26.3%。因此，該方法可以有效地富集魚油中的EPA和DHA。

3 結 論

本研究通過固定化Sn-1,3特異性脂肪酶對食品級魚油中的EPA和DHA進行富集，并通過單因素實驗得出最優富集工藝條件為pH 6、固定化Sn-1,3特異性脂肪酶用量1%～15%、純化水加入量1%～10%、水解時間2～6 h、水解溫度30～70℃，在此條件下EPA和DHA總量達到40%～60%，產品收率為48%～75%。該工藝實現了EPA和DHA的有效富集，同時經過除去甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸等后處理得到了保持天然屬性的精制魚油。該工藝能夠大大提高魚油中EPA和DHA總量，對于后續天然魚油藥品及保健品的開發提供了技術基礎。