尿素包埋法富集椰子油中月桂酸工藝條件優化

黃宏飛，馬開創，張 瑩，胡傳榮,2，何東平,2

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023； 2.國家糧食局糧油資源綜合開發工程技術研究中心，武漢 430023)

椰子油中脂肪酸以月桂酸為主，含量占45%左右[1]。此外，椰子油中還有己酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸等飽和脂肪酸及少量油酸等不飽和脂肪酸，是植物界中月桂酸和中短碳鏈脂肪酸最主要的來源[2]。這些脂肪酸的碳鏈長度都在C14以下，具有可快速消化吸收、在體內不轉化為脂肪、抑菌、抑制病毒、提高人體免疫力等重要的保健功能[3-4]。

尿素包埋法是提純脂肪酸的一種常用方法，具有投資少、成本低、操作簡單且環境污染少的優點，主要用于飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的分提，飽和脂肪酸被包埋在尿素層，不飽和脂肪酸則在溶劑層。南陽等[5]運用尿素包埋法富集椰子油中月桂酸甲酯，本實驗以椰子油混合脂肪酸為原料，以月桂酸為目的產物，在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗對尿素包埋富集月桂酸工藝條件進行優化，為椰子油中月桂酸的富集提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

椰子油，實驗室自制。碳酸鉀、甲醇、尿素、無水乙醇、正己烷、氯化鈉、BF3-甲醇，國藥集團化學試劑有限公司；液氮，上海益海嘉里有限公司。

美國安捷倫GC-7890氣相色譜儀，DF-101S集熱式磁力攪拌器，PZ-D-5型液體比重天平，TD5A離心機，DZF-6021真空干燥箱，海爾冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

取50 g椰子油樣品，置于500 mL磨口三口圓底瓶中，加入350 mL 5%的NaOH-乙醇溶液，通氮氣在75℃下回流60 min，至溶液澄清透明停止，移至分液漏斗分層，除去下層液。再將冷卻至室溫的上層液置于冰箱12 h，使皂析出，旋轉蒸發出過量的乙醇，將制得的皂化物轉入燒杯中，用10%鹽酸調pH至2～3，用飽和食鹽水沖洗至中性，轉入分液漏斗，用石油醚萃取3次，合并石油醚相，加入無水硫酸鈉干燥，回收石油醚，即得椰子油混合脂肪酸樣品。

1.2.2 尿素包埋法富集椰子油中月桂酸

取30 g制備的混合脂肪酸于三口圓底燒瓶中，加入尿素-甲醇溶液以及轉子，將三口圓底燒瓶其中一口封閉另外兩口分別進出氮氣，一定溫度下在磁力攪拌水浴鍋中攪拌一段時間，取出后冷卻至室溫，置于一定溫度下包埋一段時間，之后離心分層，去除未包埋液，保留尿素結晶層，蒸餾水溶解尿素結晶，用分液漏斗分液后加入無水硫酸鈉，最后置入真空干燥箱干燥得到以月桂酸為主的脂肪酸。

1.2.3 脂肪酸組成分析

樣品甲酯化：取0.1 g(2～3滴)椰子油原料和富集后含高純度月桂酸為主的脂肪酸分別加入10 mL離心管中，加入3 mL 0.5%的NaOH-甲醇溶液；搖勻后在65℃恒溫水浴中皂化30 min，加入2 mL BF3-甲醇(體積比1∶3)溶液，65℃恒溫水浴3 min后冷卻至室溫，加入2 mL正己烷(色譜純)萃取，搖勻后靜置分層，取上層有機相在10 mL離心管中離心20 min，過膜后移入進樣瓶中。

氣相色譜條件：Agilent 19091F-433色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；柱溫240℃；采用程序升溫，初始溫度50℃，保持2 min，以5℃/min的速率上升至180℃，保持2 min，再以8℃/min的速率上升至200℃，保持5 min；載氣為高純度N2，流量3.00 mL/min，空氣流量50 mL/min，氫氣流量50 mL/min；氫火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度250℃，進樣口溫度200℃；進樣量0.6 μL；分流比30∶1。

1.2.4 統計學分析

采用Excel 2010統計分析軟件進行基礎數據整理、分析與作圖，利用Design-Expert V8.0.6對結果進行統計分析，顯著水平取P<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 尿素與甲醇質量比對月桂酸富集結果的影響

包埋反應的溶劑要求對被包埋物有較大的溶解度，同時又不與尿素生成包埋物，根據文獻報道，選擇甲醇作為包埋溶劑[6]。當甲醇較少時，尿素不能充分溶解，溶液黏稠，分子運動阻力較大，尿素包埋不充分，導致包埋效果不好，產品純度較低。因此，尿素與甲醇質量比對富集結果有很大的影響。在尿素與甲醇質量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，尿素與混合脂肪酸質量比1∶1，水浴時間2 h，水浴溫度50℃，包埋溫度-15℃，包埋時間8 h下，氣相色譜檢測產品中月桂酸的含量。實驗結果如圖1所示。

圖1 尿素與甲醇質量比對月桂酸富集結果的影響

由圖1可知，隨著甲醇用量增加，月桂酸含量升高，在尿素與甲醇質量比為1∶2時，月桂酸含量達到最高。當尿素與甲醇質量比在1∶2～1∶4時，月桂酸含量有所下降，可能是由于過量的甲醇導致包埋逆反應加速進行，不利于包埋。因此，尿素與甲醇質量比為1∶2最佳。

2.1.2 尿素與混合脂肪酸質量比對月桂酸富集結果的影響

從理論上分析，對任何給定的包埋物，脂肪酸和尿素的比例是恒定的。包埋所需尿素的用量不隨溫度的變化而變化，包埋前體系中其他組分的濃度也不會影響尿素的用量，脂肪酸與尿素質量比只隨脂肪酸的飽和度不同而不同[7-8]。但在實際操作中，為使包埋反應完全，應加入過量的尿素。在尿素與甲醇質量比1∶2、尿素與混合脂肪酸質量比分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0，水浴時間2 h，水浴溫度50℃，包埋溫度-15℃，包埋時間8 h下，氣相色譜檢測產品中月桂酸的含量。實驗結果如圖2所示。

圖2 尿素與混合脂肪酸質量比對月桂酸富集結果的影響

由圖2可知，當尿素與混合脂肪酸質量比為1∶1時，月桂酸含量最高，隨著尿素用量的增加，富集效果并沒有明顯的上升，而尿素用量減少，富集效果明顯降低，月桂酸含量下降，這說明尿素與混合脂肪酸質量比為1∶1時，飽和脂肪酸被尿素完全包裹，此時富集效果最好。因此，尿素與混合脂肪酸質量比為1∶1最佳。

2.1.3 包埋溫度對月桂酸富集結果的影響

包埋溫度是影響富集效果的重要因素之一。在尿素與甲醇質量比1∶2，尿素與混合脂肪酸質量比1∶1，水浴時間2 h，水浴溫度50℃，包埋溫度分別為-10、-15、-20、-25℃，包埋時間8 h下，氣相色譜檢測產品中月桂酸的含量。實驗結果如圖3所示。

圖3 包埋溫度對月桂酸富集結果的影響

由圖3可知，隨著包埋溫度的降低，月桂酸含量先升高后緩慢減少。在包埋溫度為-20℃時月桂酸含量最高，為56.18%。隨著包埋溫度的降低，產品純度明顯增加，這是因為尿素包埋反應是放熱過程，溫度的降低，有利于反應向生成包埋物的方向進行[7]。當溫度低于-20℃時，原料中的不飽和脂肪酸也能與尿素形成包合物，溫度過低，乙醇和包埋物容易凝固，嚴重阻礙包埋反應的進行。同時，過低的溫度也會造成較高的能耗[9]。因此，較佳的包埋溫度為-20℃。

2.1.4 包埋時間對月桂酸富集結果的影響

包埋時間直接影響包埋進行的程度，因此包埋時間是影響富集效率的重要因素之一。在尿素與甲醇質量比1∶2、尿素與混合脂肪酸質量比1∶1，水浴時間2 h，水浴溫度50℃，包埋溫度-15℃，包埋時間分別為8、10、12、14、16 h下，氣相色譜檢測產品中月桂酸的含量。實驗結果如圖4所示。

圖4 包埋時間對月桂酸富集結果的影響

由圖4可知，隨著包埋時間的延長，月桂酸含量增加，在包埋時間為10 h時，月桂酸含量達到最大，為55.43%，而后隨著包埋時間的繼續延長，月桂酸含量稍有下降后趨于穩定，說明包埋物已充分形成，再延長包埋時間，對結果幾乎沒有影響。從經濟效益考慮，選擇10 h為合適的包埋時間。

2.1.5 水浴溫度對月桂酸富集結果的影響

水浴溫度能夠影響尿素-甲醇溶液與混合脂肪酸的混合反應程度，進而影響包埋的效果。在尿素與甲醇質量比1∶2，尿素與混合脂肪酸質量比1∶1，水浴時間2 h，水浴溫度分別為35、40、45、50、55℃，包埋溫度-15℃，包埋時間8 h下，氣相色譜檢測產品中月桂酸的含量。實驗結果如圖5所示。

圖5 水浴溫度對月桂酸富集結果的影響

由圖5可知，隨著水浴溫度的升高，富集效果逐漸升高，當水浴溫度為50℃時，富集效果最好，月桂酸含量為56.16%。隨著水浴溫度的繼續升高，月桂酸含量略有降低。因此，最佳的水浴溫度為50℃。

2.1.6 水浴時間對月桂酸富集結果的影響

水浴時間能夠影響尿素-甲醇溶液與混合脂肪酸的混合反應程度，進而影響包埋的效果。在尿素與甲醇質量比1∶2，尿素與混合脂肪酸質量比1∶1，水浴時間分別為1、2、3、4、5 h，水浴溫度50℃，包埋溫度-15℃，包埋時間8 h下，氣相色譜檢測產品中月桂酸的含量。實驗結果如圖6所示。

圖6 水浴時間對月桂酸富集結果的影響

由圖6可知，隨著水浴時間的延長，月桂酸含量逐漸上升，這是因為充分的水浴時間可以使尿素-甲醇溶液與混合脂肪酸充分混合反應，繼續延長水浴時間，月桂酸含量不再增加，這是因為反應已經充分進行，并且考慮到實驗效率，水浴時間應為3 h。

2.2 正交優化實驗[10-13]

根據單因素實驗結果，選取尿素與甲醇質量比(A)、包埋溫度(B)、包埋時間(C)、尿素與混合脂肪酸質量比(D)、水浴溫度(E)、水浴時間(F)6個因素，采用L25(56)正交表安排實驗，正交實驗因素水平見表1，正交實驗設計及結果見表2。

表1 正交實驗因素水平

由表2可知,6個因素的主次關系為E(水浴溫度)>C(包埋時間)>D(尿素與混合脂肪酸質量比)>F(水浴時間)>A(尿素與甲醇質量比)>B(包埋溫度)。優化方案為A3B4C2D3E4F5，即尿素與甲醇質量比為1∶2，包埋溫度為-20℃，包埋時間為10 h，尿素與混合脂肪酸質量比為1∶1.5，水浴溫度為50℃，水浴時間為5 h。

用確定的優化方案A3B4C2D3E4F5進行3次平行驗證實驗，得到的月桂酸含量為59.32%、60.25%、60.58%，平均含量為60.05%，高于正交表中最優的第14號實驗的月桂酸含量58.63%。所以經驗證，A3B4C2D3E4F5為最優方案。

表2 正交實驗設計及結果

2.3 富集前后脂肪酸組成(見表3)

表3 富集前后脂肪酸組成及含量 %

由表3可知，富集前月桂酸含量為50.70%，通過尿素包埋法富集后月桂酸含量為60.05%，較富集前提高了9.35個百分點。

3 結 論

通過單因素實驗和正交實驗法優化，得到尿素包埋法富集椰子油中月桂酸的優化工藝條件為：尿素與甲醇質量比1∶2，包埋溫度-20℃，包埋時間10 h，尿素與混合脂肪酸質量比1∶1.5，水浴溫度50℃，水浴時間5 h。在優化工藝條件下，富集后月桂酸含量60.05%，較富集前的50.70%提高了9.35個百分點。