油脂脫臭餾出物中多環芳烴含量及檢測方法研究

劉玉蘭，溫運啟，劉春梅，馬宇翔，潘 坤，王格平

(1.河南工業大學 糧油食品學院，鄭州 450001； 2.益海嘉里投資有限公司，上海 200120)

近年來的科學研究表明，植物油料以及利用植物油料提取的毛油中或多或少含有多環芳烴(PAHs)成分[1-2]，采用科學合理的油脂精煉工藝技術，可以將毛油中的PAHs逐步脫除[3-7]，得到符合國家食品安全標準要求的食用植物油產品。但是在油脂精煉過程中，毛油中的PAHs會在精煉副產物中富集，給副產物的后續利用尤其是作為食品原料利用帶來食品安全風險[8]。植物油富含維生素E[9]，在油脂精煉的脫臭工序，高溫高真空的水蒸氣蒸餾作用不僅可以脫除油脂中的游離脂肪酸和臭味組分[10]，還可以脫除其中的PAHs、鄰苯二甲酸酯類塑化劑等有害成分[11-12]，同時油脂中的維生素E、植物甾醇等組分也會被部分蒸餾出來[13-14]，在油脂脫臭形成的副產物即脫臭餾出物中得到富集。油脂脫臭餾出物可用來生產脂肪酸[15-16]，近年也越來越多的被用作生產天然維生素E和植物甾醇的原料[17-20]。因此，脫臭餾出物中PAHs含量可能對其作為食用或醫藥用原料的安全性造成威脅。

近年來對食用植物油中PAHs的研究著重于對油脂中PAHs的控制和脫除[21-24]，鮮有對油脂精煉副產物——脫臭餾出物中PAHs含量及風險的研究報道，也未見對其中PAHs含量檢測方法的研究。目前，食用植物油中PAHs的檢測多采用高效液相色譜法(HPLC)[25]、氣相色譜串聯質譜法(GC-MS)[26]和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[27]，GC-MS方法檢測靈敏度高，能夠滿足一般的檢測需求，應用較多[28]。但油脂脫臭餾出物組分復雜，性狀黏稠，對其中PAHs組分含量檢測的難點在于如何對其樣品進行合理的前處理。本課題針對油脂脫臭餾出物特殊的黏稠性狀和復雜組分，對其中PAHs含量檢測方法和樣品前處理條件進行優化研究，以期建立一種能夠滿足對油脂脫臭餾出物中16種PAHs組分含量檢測的GC-MS方法，并利用所建立的檢測方法對油脂脫臭餾出物中16種PAHs組分含量進行檢測，分析研究油脂脫臭餾出物中PAHs的風險，為其后續的安全利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

油脂脫臭餾出物樣品6個，其中大豆油脫臭餾出物4個，玉米油脫臭餾出物、芝麻油脫臭餾出物各1個。6個樣品均取自不同的油脂加工廠。

PAH16混標(質量濃度為200 μg/mL，98%)，O2si公司；PAH16氘代同位素內標(97%)，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；硅膠固相萃取小柱(500 mg，3 mL)，Supelco公司；色譜純乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷，美國VBS公司；色譜柱DB-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司。其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

ISQ氣相色譜質譜聯用儀(Thermo Fisher Scientific公司)，Trace 1310氣相色譜系統，配AI1310自動進樣器，Xcalibur軟件數據處理系統；I570590固相萃取裝置，Supelco公司；LD5-10臺式低速離心機；MTN-2800W氮吹濃縮儀；DW-FL270超低溫冷凍儲存箱；RE-52AA旋轉蒸發器；KQ3200DE數控超聲波清洗器；MVS-1旋渦混合器。

1.2 實驗方法

1.2.1 油脂脫臭餾出物中PAHs含量測定

油脂脫臭餾出物中PAHs含量檢測方法參照GB 5009.265—2016《食品安全國家標準 食品中PAHs的測定》中對食品中16種PAHs(萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并(a)蒽、、苯并(b)熒蒽、苯并(k)熒蒽、苯并(a)芘、茚并(1，2，3-c，d)芘、二苯并(a，h)蒽和苯并(g，h，i)苝)的氣相色譜-質譜測定方法。樣品的前處理參照Shi等[26]的方法。

上述16種PAHs的組分名稱和縮寫如表1所示。美國環境保護署(EPA)將上述16種PAHs即PAH16列為“優先控制污染物”。其中的苯并(a)蒽、、苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘4種PAHs簡稱為PAH4，歐盟No 835/2011限量規定PAH4總量為10 μg/kg[29-30]。

表1 16種PAHs(PAH16)的組分名稱和縮寫

1.2.2 標準溶液的配制及標準曲線的繪制

取PAH16混合標準儲備液(20 μg/mL)以及PAH16氘代內標混合標準儲備液(100 ng/mL)，分別稀釋標準儲備液得到質量濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的標準工作溶液，內標質量濃度均為50 ng/mL。所得標準溶液儲備于棕色瓶中，置于-20℃保存備用。將不同質量濃度的標準工作溶液進行GC-MS分析，以標準工作溶液中目標物質量濃度/內標物質量濃度為橫坐標，目標物峰面積/內標物峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 油脂脫臭餾出物樣品前處理

稱取(1.00±0.01)g脫臭餾出物溶解于2.5 mL正己烷中，旋渦振蕩，充分溶解，取0.5 mL溶解液于羅蓋試管中，加入200 μL質量濃度為100 ng/mL的內標溶液，充分振蕩混合，加入NaOH甲醇溶液2 mL，旋渦振蕩2 min，充分進行中和反應；向反應液中加入15 mL正己烷，振蕩2 min，5 000 r/min 離心3 min，取分離出的上清液于濃縮瓶中，再加入正己烷重復洗滌數次，將上清液合并，于45℃下旋蒸濃縮至30 mL左右，并于-20℃下冷凍1 h，然后5 000 r/min冷凍離心3 min，取上清液于濃縮瓶中，旋蒸至2 mL左右；再用不同體積的乙腈萃取，振蕩2 min，并于-20℃下冷凍1 h后5 000 r/min 冷凍離心3 min，取下層清液于濃縮瓶并旋蒸至2 mL；用15 mL正己烷再對乙腈濃縮液萃取數次，將正己烷溶液旋蒸濃縮至2 mL，上樣于事先用正己烷平衡好的硅膠固相萃取小柱；分別以6 mL正己烷、4 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液(體積比90∶10)淋洗小柱，收集上樣液與洗脫液，氮吹近干，復溶于400 μL乙腈，轉移至進樣小瓶中待分析。

1.2.4 回收率及重復性

取同一個脫臭餾出物樣品，將其分為3個加標組和1個空白對照組。加標水平分別為10、80、200 μg/kg，每個水平重復測定6次，計算回收率。以上選取的3個加標水平的脫臭餾出物樣品，在同一天內重復測定其含量6次，計算日內精密度；在連續6 d內每天測定其含量3次，計算日間精密度。

1.2.5 氣相色譜-質譜條件

氣相色譜條件：脈沖不分流模式進樣，進樣量1.0 μL；進樣口溫度300℃；載氣，氦氣(純度≥99.999%)；恒流模式，流速1.0 mL/min；升溫程序，80℃保持1 min，隨后以20℃/min升至180℃，3℃/min升至200℃，6℃/min升至250℃并保持3 min，再以3℃/min升至300℃并保持16 min。

質譜條件：離子源溫度300℃；傳輸線溫度300℃；電子轟擊(EI)離子源；電離能量70 eV；燈絲電流25 μA。

2 結果與分析

2.1 脫臭餾出物中PAHs檢測方法的建立

2.1.1 脫臭餾出物樣品前處理條件優化

脫臭餾出物在溫度較低時，呈現固態或半固態，不利于稱取少量樣品及均勻取樣，因此先稱取一定量的樣品溶解于正己烷中，再移取適量的正己烷溶液樣品。脫臭餾出物的基質復雜，脂肪酸含量較高，脂肪酸在很多有機溶劑中的溶解性較好，因此先用NaOH甲醇溶液中和其中的部分脂肪酸，以利于后續對PAHs的提取和凈化。當NaOH甲醇溶液的加入量不足時，脂肪酸的中和不夠徹底，當加入量過高時，形成的懸浮物對PAHs形成包裹，不利于PAHs的提取，因此根據實驗效果，確定加入2 mol/L的NaOH甲醇溶液2 mL。

乙腈是一種中等偏極性的溶劑，對PAHs有很好的溶解性，因此在PAHs的檢測中應用較多，然而直接用乙腈提取脫臭餾出物中的PAHs，導致較多的懸浮物貼壁，因此先用正己烷提取，再用乙腈萃取，可以減少最終凈化后樣品中共萃物的出現，以減少檢測分析時雜質對PAHs的干擾。實驗分別考察了正己烷用量以及乙腈用量對PAH16萃取效率的影響。其中正己烷提取PAHs時提取次數(每次15 mL)對PAH16回收率的影響如圖1所示。乙腈用量對PAH16回收率的影響如圖2所示。

由圖1可知，當正己烷提取次數為3次時，PAH16的各組分回收率達到滿意效果，為(85.54±4.57)%～(104.5±0.88)%。因此，選用正己烷提取次數為3次。

由圖2可知，當乙腈用量為30 mL時，各目標物的回收率較為滿意，為(85.49±4.23)%～(108.70±1.14)%，因此選取乙腈用量為30 mL。

乙腈萃取溶液經濃縮后仍含有一定的雜質，且旋蒸濃縮較費時，因此進一步用正己烷反萃取乙腈濃縮溶液。反萃取乙腈濃縮液時正己烷萃取次數對PAH16回收率的影響如圖3所示。

由圖3可知，當正己烷反萃取次數為2次時，PAH16的各組分回收率達到滿意效果，為(84.12±1.05)%～(104.23±3.64)%。因此，選用正己烷反萃取次數為2次。

圖1 正己烷提取次數對PAH16回收率的影響

圖2 乙腈用量對PAH16回收率的影響

圖3 正己烷反萃取次數對PAH16回收率的影響

2.1.2 洗脫溶劑的選擇以及氣相色譜和質譜條件的選擇

實驗采用硅膠柱對PAH16提取液進行凈化，洗脫溶劑的選擇、洗脫溶劑的比例、氣相色譜柱的選擇以及色譜和質譜條件的選擇均參照Shi等[26]建立的SPE凈化-同位素稀釋-GC-MS法。

2.1.3 PAH16的線性方程、檢出限、定量限

通過對1.2.2中一系列混合標準溶液的檢測和分析，并由Xcalibur軟件計算得出PAH16的線性方程、相關系數、檢出限、定量限以及線性范圍，結果如表2所示。

表2 PAH16的線性方程、相關系數、檢出限、定量限、線性范圍

續表2

PAHs線性方程相關系數(R2)檢出限/(μg/kg)定量限/(μg/kg)線性范圍/(ng/mL)Pyry=0.023 86x+0.001 841 30.999 80.280.921～500BaAy=0.018 259 8x+0.604 5680.999 60.120.401～500Chry=0.024 001 1x+0.018 528 20.999 80.140.461～500BbFy=0.025 659 6x-0.073 427 40.999 80.210.691～500BkFy=0.033 257 3x-0.036 422 10.999 50.170.561～500BaPy=0.051 958 7x-0.037 758 40.999 40.180.591～500IcPy=0.019 903 6x-0.000 522 8640.999 00.130.431～500DhAy=0.026 750 6x+0.620 6450.999 40.160.531～500BgPy=0.024 740 4x+0.003 050 060.999 10.140.461～500

由表2可知，所有目標物線性方程的相關系數為0.999 0～0.999 9，線性關系較好。各目標物的檢出限為3倍信噪比，定量限為10倍信噪比，16種PAHs的檢出限和定量限分別為0.10～0.28 μg/kg和0.33～0.92 μg/kg。因此，選定的條件能夠滿足檢測需要。

2.1.4 方法準確度與精密度

以加標回收率和相對標準偏差分別表示該實驗方法的準確度和精密度，結果如表3所示。

表3 方法的回收率及精密度

由表3可知，在3個加標水平下，各目標物的回收率在83.92%～112.34%，日內精密度小于等于10.55%，日間精密度小于等于10.32%，說明該檢測方法對脫臭餾出物中PAHs的檢測分析具有良好的精密度和重復性。

2.2 油脂脫臭餾出物中PAHs的組分含量

利用上述優化的檢測方法對脫臭餾出物中PAHs進行檢測，結果如表4所示。

由表4可知，6個油脂脫臭餾出物樣品中BaP含量范圍為7.19～15.38 μg/kg，平均值為11.89 μg/kg，PAH4的含量范圍為144.99～300.50 μg/kg，平均值為217.19 μg/kg。PAH16的含量范圍為1 722.54～2 775.15 μg/kg，平均值為2 268.85 μg/kg。其中LPAHs是脫臭餾出物中主要的PAHs污染物，占總量的90.34%～95.61%，平均含量為2 122.58 μg/kg。所有脫臭餾出物樣品中以Nap、Ace、Fl、Phe的污染程度較高，含量分別為總量的24.49%～26.16%、17.07%～26.02%、12.89%～20.22%、11.83%～17.15%，平均含量分別為576.15、493.32、397.95、346.26 μg/kg。石龍凱等[27]對40份油脂樣品中PAH16含量檢測分析結果是BaP、PAH4、PAH16的含量平均值分別為1.36、9.53、52.39 μg/kg，相比之下，本實驗所檢測的脫臭餾出物樣品中BaP、PAH4、PAH16含量分別是石龍凱等所檢測40份油脂樣品BaP、PAH4、PAH16含量平均值的8.74、22.79、43.31倍。由此可見，脫臭餾出物中PAHs的污染較為嚴重。此外，石龍凱[11]、張東東[22]等分別研究了水蒸氣蒸餾脫臭對花生油和葵花籽油中PAHs脫除效果的影響，結果顯示，花生油脫臭過程BaP、PAH4、PAH16的脫除率分別為40.79%、42.23%、47.67%，葵花籽油脫臭過程BaP、PAH4、PAH16的脫除率分別為89.64%、86.36%、89.02%(上述兩種油脂脫臭過程PAHs脫除率的不同與待脫臭油脂中PAHs含量的不同有關)，這說明隨著油脂脫臭過程PAHs的脫除，油脂中的PAHs轉移至脫臭餾出物中并在其中得到富集。

油脂脫臭餾出物的主要成分是游離脂肪酸，同時還含有多種活性成分，是提取天然維生素E和植物甾醇的主要原料，然而其中PAHs的較高含量污染和食品安全風險應引起高度關注。

3 結 論

通過對氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS)定量檢測16種PAHs的方法和樣品前處理條件的優化研究，建立了液液分配萃取-硅膠SPE柱凈化-同位素稀釋法-氣質聯用定量檢測油脂脫臭餾出物中16種PAHs的方法。方法對該脫臭餾出物中PAHs的檢出限和定量限分別為0.10～0.28 μg/kg和0.33～0.92 μg/kg，平均回收率在83.92%～112.34%，日內精密度小于等于10.55%，日間精密度小于等于10.32%。此檢測方法靈敏度高，穩定性好，能夠較為準確地對油脂脫臭餾出物中PAHs進行組分定量檢測。

對6個油脂脫臭餾出物樣品的檢測結果顯示，其中BaP、PAH4、PAH16的含量范圍分別為7.19～15.38 μg/kg、144.99～300.50 μg/kg、1 722.54～2 775.15 μg/kg，平均值分別為11.89、217.19、2 268.85 μg/kg，其中LPAHs占總量的90.34%～95.61%。油脂脫臭餾出物中PAHs的污染較為嚴重，應高度關注其作為天然維生素E和植物甾醇提取原料的食品安全風險。