大豆水溶性蛋白提取工藝優化

郝怡寧，初晨露，陳尚兵，陸晨浩，邢常瑞，袁 建

(南京財經大學 食品科學與工程學院,南京 210023)

大豆在我國常被用來制作豆制食品，可用于榨取大豆油、釀造醬油，或用于生產大豆蛋白[1]。大豆是一種極好的蛋白質來源，大豆蛋白質占大豆總質量的30%～50%，新收獲的大豆通常90%以上的蛋白質均溶于水，這部分蛋白質被稱為水溶性蛋白[2]。大豆水溶性蛋白主要由大豆球蛋白和大豆清蛋白組成，隨著大豆新鮮度的降低，大豆中的水溶性蛋白含量逐漸降低。通常來說，水溶性蛋白含量可作為大豆是否適合儲存的重要判定指標[3]。

目前，測定蛋白質含量的方法主要有凱氏定氮法、燃燒定氮法、近紅外光譜法、考馬斯亮藍法、雙縮脲法、紫外吸收法等，其中測定大豆蛋白含量的主要方法是凱氏定氮法和考馬斯亮藍法。現有測定大豆水溶性蛋白含量的方法主要有NY/T 1205—2005、GB/T 19541—2017 和GB/T 31785—2015。NY/T 1205—2005需要對大豆水溶性蛋白多次提取，步驟較為煩瑣。GB/T 19541—2017附錄A，用氫氧化鉀提取大豆水溶性蛋白的方法雖然過程簡單，用時較短，但穩定性較差。GB/T 31785—2015中提取大豆水溶性蛋白的方法，提取率較低。為了簡化大豆水溶性蛋白提取的操作步驟，提高大豆水溶性蛋白提取過程中的穩定性，減少實驗誤差，本文對影響大豆水溶性蛋白的提取因素進行討論，通過正交實驗得到最佳的提取條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆(東北64)：江蘇省農科院，于0～4℃儲藏。硼酸(H3BO3)，2 g/100 mL；氫氧化鈉(NaOH)，40 g/100 mL；硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸。

TDL-5-A型離心機，DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽，KX-100型高速多功能粉碎機，電子天平(0.01 g)，電子分析天平(0.1 mg)，電熱鼓風干燥箱,BUCHIK-436快速消解儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆水溶性蛋白的提取

大豆經粉碎磨成粉，混勻備用。取一定量(精確到0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入一定量蒸餾水，使勁搖晃使得試樣不結塊，均勻分散。將離心管固定于水浴鍋在一定溫度下振蕩提取一定時間。取下離心管，以3 000 r/min離心10 min，將上清液倒入250 mL容量瓶中并定容。

1.2.2 大豆水溶性蛋白含量的測定

取10 mL樣品液于消化管中，同時向消化管中加入12 mL濃硫酸和催化劑。消化結束后采用全自動凱氏定氮儀進行測定。

水溶性蛋白含量(w)按下式計算。

式中:V1為滴定樣品液消化液所耗硫酸的體積，mL；V0為滴定空白液消化液所耗硫酸的體積，mL；C為硫酸標準滴定溶液濃度，mol/L；0.014 0為1.0 mL硫酸[C(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]標準滴定溶液相當的氮的質量，g；6.25為大豆含氮量換算成蛋白質的系數；m為10 mL樣品液對應的試樣質量，g。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對大豆水溶性蛋白含量的影響

取5.000 g(精確到0.001 g)樣品于50 mL離心管中，取50 mL蒸餾水加入離心管中。將離心管固定至恒溫(35℃)水浴鍋分別振蕩30、60、90、120、150 min。以3 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察提取時間對大豆水溶性蛋白含量的影響，結果見圖1。

圖1 提取時間對大豆水溶性蛋白含量的影響

從圖1可以看出，隨著提取時間的延長，大豆水溶性蛋白含量在30～90 min內顯著增加，在90 min以后大豆水溶性蛋白含量變化不大，幾乎處于平穩。大豆水溶性蛋白與蒸餾水之間的溶質濃度的平衡關系最終決定大豆水溶性蛋白的提取時間，為了保證大豆水溶性蛋白含量和穩定，選擇120 min為最佳提取時間。

2.1.2 料液比對大豆水溶性蛋白含量的影響

取1.000 g(精確到0.001 g)磨碎的大豆樣品于50 mL離心管中，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50向其加入蒸餾水，搖勻。在水浴鍋內35℃振蕩60 min，以3 000 r/min的轉速離心10 min。取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察料液比對大豆水溶性蛋白含量的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對大豆水溶性蛋白含量的影響

從圖2可以看出，當加水量較低時，大豆水溶性蛋白不能完全從大豆中析出，有一小部分殘留在殘渣中，使得水溶性蛋白含量偏低，隨著加水量的增加，大豆水溶性蛋白含量整體趨勢先上升，直到料液比達到1∶35時，大豆水溶性蛋白含量才趨于穩定。為了確保穩定并較為準確地提取大豆水溶性蛋白，采用料液比為1∶40。

2.1.3 提取溫度對大豆水溶性蛋白含量的影響

取5.000 g(精確到0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入50 mL蒸餾水，搖勻。在不同溫度(15、20、25、30、35、40℃)的水浴鍋中振蕩60 min，以3 000 r/min的轉速離心10 min。取上清液倒入250 mL容量瓶中，定容。考察提取溫度對大豆水溶性蛋白含量的影響，結果見圖3。

圖3 提取溫度對大豆水溶性蛋白含量的影響

從圖3可以看出，提取溫度低于25℃時，隨著溫度的升高，水溶性蛋白質含量明顯上升，當提取溫度在25～30℃時，溫度升高，水溶性蛋白質含量有小幅度的提高。因為隨著溫度的升高，一些難溶于水的蛋白質(如球蛋白)溶解于水，造成水溶性蛋白含量增加。當提取溫度在30～40℃時，大豆水溶性蛋白含量穩定。為了提高實驗效率并較為準確地測定大豆中水溶性蛋白含量，選擇35℃ 為最佳提取溫度。

2.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，以大豆水溶性蛋白含量為評價標準，選擇提取溫度、提取時間、料液比進行三因素三水平L9(34)正交實驗。正交實驗因素水平見表1，正交實驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交實驗因素水平

表3 方差分析

從表2可以看出，在3個因素中影響大豆水溶性蛋白含量的最主要因素是提取時間，其次是料液比，最后為提取溫度，最優組合為A3B1C2。綜合各因素作用，最終確定提取大豆水溶性蛋白最佳工藝條件為：提取溫度30℃，提取時間120 min,料液比1∶40。在最佳工藝條件下，進行3次重復驗證實驗，所得大豆水溶性蛋白含量為34.63%。

從表3可以看出，提取溫度、提取時間和料液比對大豆水溶性蛋白含量均有顯著影響，都為主要的影響因素，具有統計學意義。

3 結 論

以東北大豆為原料，通過單因素實驗及正交實驗，并綜合考慮各因素在實際中的簡便、可行性，最終確定大豆水溶性蛋白提取的最佳工藝條件為：料液比 1∶40，提取時間 120 min，提取溫度 30℃。在最佳工藝條件下，大豆水溶性蛋白含量為34.63%。