酶促酯化制備DAG過程中的酰基轉移研究

宋志華，魯 珊，黃健花，金青哲，王興國

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

甘二酯，又稱甘油二酯、脂肪酸甘油二酯(DAG)，按空間異構分為1,3-甘二酯(1,3-DAG)和1,2-甘二酯(1,2-DAG)兩類，兩類DAG的功能差異較大，前者可抑制脂肪積累、預防肥胖及肥胖引發的相關疾病[1]，后者具有細胞信號分子、促進傷口愈合、改善糖尿病大鼠心肌功能紊亂[2-3]等作用。

酶促催化制備DAG工藝途徑主要包括酯交換法和直接酯化法。充分利用不同酶促催化位點的不同，制取獲得特定構型或特定脂肪酸DAG已成為當前研究的熱點。祝雨筱等[3]利用Lipozyme 435催化酯交換合成1,2-DAG，劉四磊等[4]利用Lipozyme RM IM催化酯化制取富含花生四烯酸的1,3-DAG。然而，不管是酯交換法還是直接酯化法，都會伴隨酰基轉移產生一些副產物，如單甘酯(MAG)、甘三酯(TAG)；同時，現有關于酶促催化制備DAG的研究，主要集中于酶篩選、催化參數優化方面[3-5]。有關酰基轉移的研究報道也主要針對酶促催化的酯交換反應體系，如：Laszlo等[6]研究酶促催化高油酸葵花籽油-乙醇酯交換體系酰基遷移動力學；李人望[7]研究了酶促催化單甘酯-甲醇酯交換體系中溶劑對脂肪酶位置選擇性和酰基轉移的影響；Pacheco等[8]研究了酶促催化大豆油-完全氫化大豆油酯交換體系的酰基轉移情況。鮮有關于酶促催化酯化反應體系酰基轉移規律的研究和報道。因此，研究探討酶促催化酯化制備DAG反應體系下的酰基轉移規律，對于豐富和完善酶促催化基礎理論體系，指導DAG合成、獲得特定高純DAG產物具有重要意義。本文采用Sn-1,3特異性脂肪酶Lipozyme RM IM為催化劑，以油酸和甘油的酶促酯化反應體系為模型，初步探討酶促酯化制備DAG過程中的酰基轉移規律，以期為酶促催化酯化制備DAG過程中的酰基轉移調控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Lipozyme RM IM，諾維信生物技術有限公司；甘油、油酸、乙酸均為分析純，國藥化學試劑有限公司；異丙醇、正己烷均為色譜純，北京百靈威科技有限公司。

Re-501型旋轉蒸發器，Waters1525高效液相色譜儀，Alltech3300蒸發光散射檢測器， Waters Spherisorb Silica 色譜柱(2.0 mm×250 mm，5 μm)，AR2140精密電子天平。

1.2 試驗方法

1.2.1 酯化合成DAG

按一定摩爾比稱取適量的油酸與甘油置于50 mL圓底燒瓶，添加一定量脂肪酶，在一定溫度的水浴下真空旋轉反應(80 r/min，0.1 MPa)，反應過程中按一定時間間隔取樣， 分析產物的甘油酯組成。所有試驗因素水平均同時進行3次重復試驗。

1.2.2 酯化產物甘油酯組成分析

取酯化產物0.5 mL，加入0.5 mL高純水和5 mL正己烷，旋渦振蕩萃取1 min，離心收集有機相，氮吹揮干溶劑后定容至10 mL進行HPLC分析。

檢測條件[9]：Spherisorb Silica 色譜柱(2.0 mm×250 mm，5 μm)；柱溫35℃；流動相A為正己烷-異丙醇(體積比99∶1)，流動相B為正己烷-異丙醇-乙酸(體積比1∶1∶0.01)；采用梯度洗脫，0～10 min A由100%降至80%，10～14 min A由80%降至70%，14～15 min A由70%升至100%并保持5 min；流動相流速0.5 mL/min；進樣量10 μL；蒸發光散射檢測器漂移管溫度75℃。采用面積歸一化法進行定量。

1.2.3 酯化反應酰基轉移表征

Lipozyme RM IM為1,3-特異性脂肪酶，故反應體系的酰基轉移產物主要為1,2-DAG、2-MAG和TAG，檢測酰基轉移產物組成發現2-MAG未檢出，故本文采用酰基轉移產物中1,2-DAG在DAG的占比直觀反映體系中DAG的酰基轉移情況，同時，對體系的DAG含量變化情況進行監測。1,2-DAG在DAG的占比以酰基轉移率表示，計算公式如下。

酰基轉移率=1,2-DAG含量/(1,2-DAG含量+1,3-DAG含量)×100%

2 結果與討論

2.1 酯化時間對酰基轉移的影響

在底物(油酸與甘油)摩爾比2∶1、酯化溫度65℃、Lipozyme RM IM添加量6%(以底物總質量計，下同)的條件下，探討酯化時間對酶促酯化合成DAG過程中酰基轉移的影響，結果如圖1所示。

圖1 酯化時間對酶促酯化合成DAG過程中 酰基轉移的影響

由圖1可知，酰基轉移率隨酯化時間的延長不斷增加，10 h時的酰基轉移率達26.1%。同時發現，隨著酯化時間的延長，體系中DAG的含量先增加后下降，在2 h時DAG含量最高，之后隨酯化時間延長DAG含量下降。這是由于隨著反應進行DAG進一步反應生成TAG，而Lipozyme RM IM催化生成TAG過程中，1,2-DAG較1,3-DAG更易發生反應，故隨著反應的進行，1,3-DAG不斷發生酰基轉移形成1,2-DAG，導致酰基轉移率隨之不斷增加[10]。因此，反應時間控制在1 h以內可以盡可能減少酰基轉移發生，保證體系產物具有較高的1,3-DAG含量。

2.2 底物摩爾比對酰基轉移的影響

根據甘油與脂肪酸酯化反應的理論方程，綜合考慮反應效率和成本，酶促酯化制備DAG過程中，脂肪酸與甘油的理論最佳摩爾比為2∶1。改變底物組成會影響體系的擴散傳質，進而影響反應，脂肪酸含量過高，利于反應過程中1,3-DAG酰基轉移形成1,2-DAG和生成TAG；甘油含量增加則體系黏度加大、極性增強，不利于其與脂肪酸的有效接觸，進而影響反應速率[11]。在酯化溫度65℃、酯化時間2 h、Lipozyme RM IM 添加量6%的條件下，探討底物(油酸與甘油)摩爾比對酶促酯化合成DAG過程中酰基轉移的影響，結果如圖2所示。

圖2 底物摩爾比對酶促酯化合成DAG過程中 酰基轉移的影響

由圖2可知，底物摩爾比對反應體系的酰基轉移影響不大，不同底物摩爾比反應時的酰基轉移率變化不大，基本在11%左右，在底物摩爾比為2∶1時酰基轉移率相對略低，符合理論最佳值。不同底物摩爾比反應產物的DAG含量也無明顯差異。這可能是由于脂肪酶具有活性位點，其通常被α-螺旋“蓋子”遮蓋，只有當吸附于油-水界面時才會在油相疏水作用下，打開“蓋子”，暴露活性位點，發生催化作用[12]。而本實驗條件下底物摩爾比的改變對酶在油水界面發揮催化作用的影響不大。底物摩爾比過小，甘油反應不充分，DAG含量略低；底物摩爾比過大，脂肪酸過量導致TAG含量增加、DAG含量下降。綜合評估，當底物摩爾比控制在2∶1時，體系的酰基轉移率最低，產物中1,3-DAG含量最高。

2.3 酶添加量對酰基轉移的影響

在底物(油酸與甘油)摩爾比2∶1、酯化溫度65℃、酯化時間2 h的條件下，探討酶添加量對酶促酯化合成DAG過程中酰基轉移的影響，結果如圖3所示。

圖3 酶添加量對酶促酯化合成DAG過程中 酰基轉移的影響

由圖3可知，當酶添加量分別為2%、4%和6%時，對應的酰基轉移率分別為9.8%、10.6%和10.5%，酰基轉移率變化不大，相應的DAG含量則從48%上升到68%。這是由于一開始酶添加量較低時，酶在油-水反應界面的濃度隨酶添加量的增加而逐漸增大，從而有效提高了反應速率[13]，導致DAG含量的增加。當進一步增大酶用量時，酰基轉移率與DAG含量的變化趨勢相反，即DAG含量呈現降低趨勢，酰基轉移率則明顯增加，酰基轉移率由10.5%(酶添加量6%)增加至15.2%(酶添加量10%)。說明當酶添加量達到6%時，酶基本在油-水反應界面達到飽和，此時進一步增加酶用量，導致副反應增加[14]，形成更多的副產物TAG，進而推動1,3-DAG的酰基轉移，導致酰基轉移率的增加。因此，在現有反應條件下，6%的酶添加量可以保證產物具有較高的1,3-DAG含量。

2.4 酯化溫度對酰基轉移的影響

通常酶具有最適溫度，在最適溫度下表現出理想的催化活性。在底物(油酸與甘油)摩爾比2∶1、酯化時間2 h、Lipozyme RM IM 添加量6%的條件下，探討酯化溫度對酶促酯化合成DAG過程中酰基轉移的影響，結果如圖4所示。

圖4 酯化溫度對酶促酯化合成DAG過程中 酰基轉移的影響

升高酯化溫度，利于降低體系黏度，提高底物間相容性，加快傳質，提升反應速率；同時，本研究所采用的反應裝置帶有真空脫水功能，在一定范圍內升高酯化溫度，有利于反應產物水的脫除，促進反應向正反應方向進行；然而，當酯化溫度過高時，會影響酶的空間結構和構象，降低酶的活性。由圖4可知，酯化溫度升高明顯促進酰基轉移，45℃時的酰基轉移率僅為6.4%，而75℃時的酰基轉移率達15.1%。即使在75℃酶活降低的情況下，酰基轉移率仍較65℃反應體系明顯增加，這是由于隨著酯化溫度的進一步升高(高于65℃)，熱力學平衡占據主導地位，酰基轉移急劇增加所致[15]。因此，酯化溫度應控制在65℃為宜。

3 結 論

Sn-1,3特異性脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化油酸和甘油合成DAG的過程中，體系的酰基轉移情況呈現如下規律：酯化溫度和酯化時間與體系酰基轉移率呈現正相關性，酯化溫度的升高或酯化時間的延長，都會明顯促進酰基轉移；底物(油酸與甘油)摩爾比對酰基轉移影響不大，但會影響DAG的得率；酶添加量在油-水反應界面達到飽和之前，酶添加量的變化對酰基轉移的影響不大，當酶添加量達到飽和之后，進一步增加酶添加量，則會加劇體系的酰基轉移。