不同比例LA/ALA對HepG2細胞炎癥因子的影響

劉睿杰，塔 薇，王莉梅，常 明，金青哲，王興國

(1.江南大學 食品學院，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122；2.無錫易麥園食品有限公司，江蘇 無錫 214000)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是人體必需的重要營養物質，包括n-6和n-3 PUFAs，具有抗氧化、抗炎等生理作用，在人體健康中起重要作用。膳食中n-6與n-3 PUFAs 的攝入比例一直備受關注，但目前各國膳食脂肪酸構成比的推薦值不盡相同，諸多體內和體外實驗結果中n-6與n-3 PUFAs最佳比例尚無定論。

PUFAs可以調節炎癥反應過程的炎癥因子表達[1]，是類花生酸前物質，可代謝生成抗炎性類花生酸物質，在炎癥反應中發揮重要作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)是炎癥反應過程中最重要、最具代表性的細胞因子，前者對后者有很強的促進作用。IL-6是一種自分泌或旁分泌的多效性細胞因子，在許多細胞中都有明顯的表達，當炎癥發生時，IL-6的量迅速增加，影響炎癥反應過程[2-4]。有報道稱可通過檢測TNF-α和IL-6水平高低來反映炎癥的嚴重程度[5]。白介素-10(IL-10)是一種多肽，由多種不同類型的細胞產生，在調節過度的免疫應答和炎癥反應的最終結局方面發揮多效性作用，可以抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產生[6]。PUFAs代謝產生的抗炎性物質如脂氧素(LXs)、保護素等可調控炎癥反應，由PUFAs衍生而來的抗炎性脂氧素是最有效的炎癥調節劑[7-8]。

n-3 PUFAs有抗炎作用，可有效抑制TNF-α、IL-6以及IL-1等細胞炎性因子的產生[9-11]。Weldon等[12]研究發現，EPA和DHA可抑制人靜脈內皮細胞產生IL-6。Zhang等[13]研究發現，n-3 PUFAs通過減少炎性細胞因子TNF-α、IL-6、環氧合酶-2(COX-2)以及IL-1的分泌來抑制大鼠術后的炎癥反應。EPA可有效降低經前列腺素刺激的人肝細胞產生TNF-α和IL-6[14]。AA可代謝生成前列腺素E2和白三烯，這兩種物質在炎癥反應中起很大作用[15]。目前關注n-3與n-6 PUFAs 比例的研究多集中于EPA和DHA，對植物油中典型的n-3與n-6 PUFAs比例的關注較少。

本研究通過體外培養HepG2細胞，選取植物油中典型n-3和n-6多不飽和脂肪酸(α-亞麻酸(ALA)和亞油酸(LA))為代表，以促炎因子TNF-α、IL-6以及抗炎因子IL-10和抗炎介質LXA4為目標因子，研究不同比例LA/ALA對HepG2細胞炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

α-亞麻酸(ALA，純度≥99%)、亞油酸(LA，純度≥99%)及四甲基偶氮唑藍(MTT)，美國Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、DMEM培養基，美國Gibco公司；胰酶及雙抗，吉諾生物醫藥技術有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，上海生工生物有限公司；乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀等(分析純)，國藥化學試劑有限公司；脂多糖(LPS)，美國Sigma公司；TNF-α、IL-6及IL-10酶聯免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所；LXA4酶聯免疫試劑盒，上海豐壽實業有限公司；人HepG2(ATCC HB-8065)細胞株，無錫萊弗思生物實驗器材有限公司。

1.1.2 儀器與設備

TS100-F倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司；二氧化碳培養箱、HFU 586 Basic超低溫冰箱，美國Thermo公司；M5酶標儀，美國Molecular Devices公司；SCIENTZ JY 92-IIN超聲波細胞粉碎機；Alpha-l 500紫外可見分光光度計；血球計數器。

1.2 實驗方法

1.2.1 HepG2細胞培養

HepG2細胞培養于含有10%胎牛血清以及1%雙抗的DMEM培養基中，置于37℃、5% CO2和95%相對濕度的二氧化碳培養箱中，隔天換液，5 d傳代。本實驗所用細胞均為10～30代HepG2細胞。

1.2.2 不同比例LA/ALA對HepG2細胞影響

取對數生長期HepG2細胞，以105個/mL密度接種于6孔板中，在細胞培養液中先加入0.1 μg/mL LPS刺激24 h后，用磷酸緩沖液(PBS)洗兩次，再分別加入終濃度為60 μmol/L各實驗組溶液(見表1)，設立與實驗組含相同濃度BSA的空白對照組。各組樣品處理24 h后收集細胞培養液，離心除去死細胞，取上清液待分析。

表1 各實驗組脂肪酸組成

1.2.3 酶聯免疫法測定細胞TNF-α、IL-6、IL-10和細胞脂氧素水平

取1.2.2待分析液，用酶聯免疫試劑盒測定細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和LXA4水平。以各處理條件下炎性因子表達量、脂氧素水平相對于空白對照組的含量表示PUFAs處理后的變化。

1.2.4 數據統計分析

2 結果與討論

2.1 不同比例LA/ALA對HepG2細胞TNF-α和IL-6的影響

LPS誘導HepG2細胞24 h后，刺激細胞產生炎癥因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2細胞24 h后，各實驗組對HepG2細胞TNF-α和IL-6水平的影響結果見圖1。

TNF-α和IL-6均是細胞內促炎因子，其水平高低可反映細胞炎癥的嚴重程度。由圖1可知，各實驗組細胞TNF-α和IL-6的表達量與空白對照組相比顯著下降(P<0.05)；與組4相比，其余各組TNF-α和IL-6表達量均顯著上升(P<0.05)。各實驗組對HepG2細胞TNF-α和IL-6表達量抑制程度的順序為組4>組3>組2≈組1，組4>組5>組6≈組7。說明不同比例LA/ALA均能降低HepG2細胞的TNF-α和IL-6表達量，其中組4作用效果最明顯。

注：*P<0.05，與空白對照組對比的顯著性；#P<0.05，與組4對比的顯著性。下同。

圖1 不同比例LA/ALA對HepG2細胞TNF-α和IL-6含量的影響

2.2 不同比例LA/ALA對HepG2細胞IL-10的影響

LPS誘導HepG2細胞24 h后，刺激細胞產生炎癥因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2細胞24 h后，各實驗組對HepG2細胞分泌IL-10水平的影響結果見圖2。

圖2 不同比例LA/ALA對HepG2細胞IL-10含量的影響

IL-10是細胞內的抗炎因子，可以抑制促炎性細胞因子的產生，起到免疫調節作用，在維持機體免疫平衡方面發揮重要作用。由圖2可知，與空白對照組相比，各實驗組HepG2細胞產生的IL-10的含量顯著上升(P<0.05)；與組4相比，其余各組IL-10含量均顯著下降(P<0.05)。各實驗組對HepG2細胞IL-10表達量增加程度的順序為組4>組3>組2≈組1，組4>組5>組6≈組7。說明不同比例LA/ALA均能升高HepG2細胞的IL-10表達量，其中組4作用效果最顯著。

2.3 不同比例LA/ALA對HepG2細胞脂氧素水平的影響

LPS誘導HepG2細胞24 h后，刺激細胞產生炎癥因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2細胞24 h后，各實驗組對HepG2細胞分泌LXA4水平的影響結果見圖3。

圖3 不同比例LA/ALA對HepG2細胞LXA4含量的影響

PUFAs能經酶促氧化產生具有抗炎活性的LXA4。由圖3可知，與空白對照組相比，各實驗組均顯著性促進HepG2細胞LXA4合成(P<0.05)。其余各實驗組與組4相比，LXA4水平明顯均有降低(P<0.05)，作用效果存在差異。作用順序為組4>組3>組2≈組1，組4>組5>組6≈組7，組4對細胞LXA4水平的增加作用最顯著。

3 結 論

60 μmol/L不同比例LA/ALA作用經LPS誘導的HepG2細胞24 h后，各實驗組均顯著抑制HepG2細胞的促炎因子TNF-α和IL-6的產生，增加抗炎因子IL-10的產生。說明不同比例LA/ALA增加了IL-10的表達量，使抗炎因子IL-10發揮其多效性，使得促炎因子TNF-α和IL-6表達量下降，從而發揮調節炎癥，降低炎癥反應程度。同時，不同比例LA/ALA還通過增加抗炎脂類介質LXA4含量，影響HepG2細胞的炎癥反應，其中LA與ALA最佳配比為1∶1。