芍甘木瓜湯對腦卒中后痙攣大鼠神經遞質的影響?

王小萌，吳全娥

(1. 黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱 150036； 2. 河北中醫學院基礎醫學院，石家莊 050200)

超過90%的腦卒中患者會出現偏癱性側肢體痙攣現象，主要表現為肌肉群的肌張力增高、協調出現異常[1]。目前，抗腦卒中恢復期痙攣的藥物主要是改變中樞神經遞質的含量和功能，雖然能改善肌肉痙攣的癥狀，但也會影響到正常的肌張力，而芍甘湯出自《傷寒論》，是酸甘化陰的方劑，在臨床主要用于緩解肌肉痙攣等癥狀[2]。而木瓜根據《神農百草經》的記述“溫能散濕，酸能滋肝、舒筋，故能治轉筋血痹”。現代醫學研究指出，木瓜和芍藥具有協同作用，二者均有抗炎鎮痛、護肝舒筋、參與機體免疫反應的作用。芍藥可以收斂肝陰，木瓜輔之，酸收斂陰之力可以劇增，而如果獨用木瓜則效果并不明顯，而且木瓜有健脾化濕的功效，濕化則筋脈通暢，轉筋則自除[3]。臨床研究表明，芍甘木瓜湯可以被用來改善腸腓肌痙攣的癥狀[4]，但有關芍甘木瓜湯對腦卒中后肢體痙攣的作用還未見報道。因此，本文以在芍甘湯中加入木瓜，并輔以具有止痛、活血作用的川芎和川牛膝，配置成加味芍甘木瓜湯對腦卒中痙攣大鼠模型進行灌胃，研究其對痙攣大鼠模型肌張力和神經遞質的影響，以期為芍甘木瓜湯在腦卒中痙攣患者康復中的應用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 實驗選用60只健康清潔級SD雄性、體質量(200±10) g的大鼠，由黑龍江省中醫藥大學提供。實驗開始前7 d在飼舍內進行適應性飼養，溫度為(22±2) ℃，每天8∶00～20∶00為光照時間，自由飲水和飲食。

1.1.2 藥材 實驗用藥材飲片(白芍藥、木瓜、甘草、川芎、川牛膝)由黑龍江省中醫藥大學提供，經50 ℃烘干、粉碎后過40目篩制成原粉。將白芍藥、木瓜、甘草、川牛膝、川芎原粉按5∶3∶2∶2∶1的比例配成復方藥粉后，以固液比1∶10加水煎煮2次，每次煎煮90 min，取過濾后藥汁混合，濃縮藥汁使1 mL的藥液相當于1 g的藥粉，制成實驗藥液。

1.1.3 實驗試劑 異硫氰酸熒光素、半胱氨酸購自美國Amresco公司，谷氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、γ-氨基丁酸、5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素標準品購自美國Sigma公司，正庚烷、冰乙酸、鹽酸、鄰苯二甲醛、高碘酸鈉、四硼酸鈉、亞硫酸鈉購自天津化學試劑有限公司。

1.1.4 實驗儀器 精密電子分析天平(瑞士賽多力斯儀器公司)、生理記錄儀(美國BIOPAC公司)、高速低溫離心機(美國Sigma公司)、高效毛細管電泳(美國Biorad公司)、熒光分光光度計(瑞士Tecan公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 腦卒中后痙攣模型的建立 根據劉鴻燕的方法建立大鼠內囊電損毀模型[5]。在預飼養第7天隨機選擇大鼠10只作為空白對照組，再隨機選擇大鼠10只作為假手術組，剩余40只大鼠用于建造內囊電損毀痙攣模型。將大鼠麻醉，頭部剪毛固定，沿顱頂矢狀縫縱行切口確定內囊位置，用電鉆在顱板鉆孔，將電極陽極垂直插入通直流電刺激，以毀損內囊，刺激后拔出電極，縫合皮下組織及皮膚。

1.2.2 設計和分組 實驗采用單因素設計，大鼠根據實驗處理不同被分為對照組、假手術組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量物組每組各10只，以造模第1天為實驗第1天，實驗期28 d，在實驗期內保持與預飼養期相同的飼養方式，具體處理方法如下：對照組選用未做任何處理的大鼠，每天按1.0 mL/100 g灌胃生理鹽水；假手術組對正常大鼠做鉆孔手術但不損毀內囊，每天按1.0 mL/100 g灌胃生理鹽水；模型組每天按1.0 mL/100 g給造模大鼠灌胃生理鹽水；低劑量組每天按0.5 mL/100 g給造模大鼠灌胃藥液；中劑量組每天按1.0 mL/100 g給造模大鼠灌胃藥液；高劑量組每天按1.5 mL/100 g給造模大鼠灌胃藥液。

1.2.3 檢測指標與方法 (1)伸直幅度測定：分別在造模后第1天給藥治療前和給藥治療的第25天采用多導生理記錄儀測量大鼠痙攣肢體的伸直幅度。將電刺激針的一端插入被固定到刻度板大鼠的痙攣側上肢朧三頭肌內，另一端則插入大鼠的尾部，并在痙攣側上肢下端系一根絲線，將絲線經傳感器與生理記錄儀連接，對朧三頭肌定時進行2 mA的電刺激，記錄實驗大鼠上肢伸直的幅度(cm)。

(2)氨基酸類神經遞質含量檢測：在實驗第28天將大鼠麻醉后處死取頭部，在冰浴上迅速將大鼠的大腦和脊髓剝離，取內囊稱重后放入到預冷組織勻漿器中，按固液比10∶1加入冰浴的超純水，勻漿致無顯著懸浮物轉移到10 mL離心管中，4 ℃條件下5000 r/min離心15 min，取上清分裝后-80 ℃超低溫冰箱凍存備用。采用高效毛細管電泳法對大鼠內囊中的谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸等氨基酸類神經遞質含量檢測。將谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸標準液制成混合標準液，按2、4、8、16、32倍稀釋成混合標準品。取組織上清液5 mL，加0.01 M的異硫氰酸熒光素25 mL和四硼酸鈉緩沖液50 mL混勻，室溫避光靜置12 h。測定混合標準品和待測樣品的峰面積。根據各濃度標樣峰面積計算標準曲線及回歸方程，并根據方程計算待測樣品各指標含量。

(3)單胺類神經遞質檢測：實驗采用熒光法分光光度法對大鼠內囊的單胺類神經遞質進行檢測。樣品與(2)中所制備的樣品相同。5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素分別按2、4、8、16、32倍稀釋制成標準品。另取凍存2.5 mL，依次加入正庚烷5 mL、0.1 M鹽酸1 mL振蕩混勻，3000 r/min條件下離心5 min，取水相備用。取0.4 mL水相液體，依次加入0.05%半胱氨酸0.1 mL、鄰苯二甲醛3.0 mL、0.02%高碘酸鈉0.1 mL，沸水浴10 min冷卻，在熒光值365/480 nm條件下，檢測各濃度標準品和待測樣品5-羥色胺的含量。取0.5 mL水相液體，依次加入乙酸緩沖液1. 5 ml、EDTA緩沖液0.4 mL、0.1 M高碘酸鈉2 mL、堿性亞硫酸鈉4 mL，沸水浴2 min冷卻。使用熒光分光光度計在310/370 nm條件下，檢測各濃度標準品和待測樣品多巴胺的含量；在熒光值365/480 nrn條件下，檢測各濃度標準品和待測樣品去甲腎上腺素含量。根據各濃度標樣計算標準曲線及回歸方程，并根據方程計算待測樣品各指標含量。

1.3 統計學方法

2 結果與分析

2.1 對大鼠上肢伸直幅度影響

表1顯示，在術后第1天給藥前，對照組和假手術組大鼠上肢伸直幅度比較差異無統計學意義(P>0.05)，但對照組和假手術組的上肢伸直幅度顯著低于其余各組造模大鼠(P<0.05)。在給藥第25天，模型組大鼠上肢伸直幅度依然顯著低于對照組和假手術組(P<0.05)，各給藥組大鼠上肢伸直幅度有增高趨勢，并顯著高于模型組(P<0.05)，而高劑量組大鼠上肢伸直幅度顯著高于低劑量組(P<0.05)。

2.2 對大鼠內囊氨基酸類神經遞質含量影響

表2顯示，在給藥第28天，模型組大鼠內囊γ-氨基丁酸含量顯著低于其他各組(P<0.05)，高劑量組γ-氨基丁酸與對照組、假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)，中劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)，并顯著低于對照組和假手術組(P<0.05)，但與高劑量組和中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組大鼠內囊甘氨酸含量顯著低于其他各組(P<0.05)，低劑量組甘氨酸顯著低于對照組、假手術組和高劑量組(P<0.05)，但與中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，中、高劑量組甘氨酸與對照組和假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組大鼠內囊谷氨酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)，各給藥組谷氨酸隨著劑量的顯著降低(P<0.05)，高劑量組與對照組和假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組大鼠內囊天門冬氨酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)，低劑量組內囊天門冬氨酸顯著高于高劑量組、對照組和假手術組(P<0.05)，但與中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，高劑量組、中劑量組、對照組和假手術組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 對大鼠上肢伸直幅度的影響(cm)

注：與對照組比較：1)P<0.05)；與模型組比較：2)P<0.05

表2 對大鼠內囊氨基酸類神經遞質含量的影響(μg/g)

注：與對照組比較：1)P<0.05)；與模型組比較：2)P<0.05

2.3 對大鼠內囊單胺類神經遞質含量的影響

表3顯示，在給藥第28天，模型組大鼠內囊5-羥色胺、去甲腎上腺素含量顯著低于其他各組(P<0.05)，各給藥組的5-羥色胺、去甲腎上腺素隨著給藥劑量的增加有增加趨勢，其中高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組與對照組和假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組和低劑量組大鼠內囊多巴胺含量顯著低于其他各組(P<0.05)，對照組、假手術組、中劑量組和高劑量組間內囊多巴胺比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 對大鼠內囊單胺類神經遞質含量的影響(ng/g)

注：與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討論

內囊是腦卒中的好發部位，當內囊發生損傷時將對下行神經的功能造成阻斷。有研究指出，在正常情況下，α運動神經元和γ運動神經元通過相互制約、相互作用共同對肌張力起調控作用，并受到高位的中樞調控。當下行神經被阻斷后，肢體則會出現肌張力過高造成的痙攣狀況[6]。所以，內囊電損毀法常被用來制造大鼠腦卒中痙攣模型，該方法成功率高、動物模型死亡率也比較低。在本實驗中，對照組和假手術組大鼠均能正常活動，而造模后大鼠則不同程度地出現不能完全伸展對側前爪、向對側轉圈和傾倒的現象，但并未出現不能行走的大鼠，這說明本實驗的造模是成功的。

腦卒中痙攣的主要臨床表現就是肌群的肌張力增高，當腦卒中患者偏癱肢體的肌張力增高時，其伸直的幅度則會降低[7]。在本研究中，模型組大鼠的肢體伸直幅度顯著低于空白組和假手術組，說明模型組大鼠肌張力顯著增加。在給模型大鼠進行芍甘木瓜湯藥液灌胃治療28 d后，腦卒中痙攣大鼠肢體的伸直幅度顯著增加，表明模型大鼠的肌張力有不同幅度的下降，說明本實驗所采用的復方藥液可以有效降低腦卒中造成的肌張力增高現象，且有一定的藥物濃度依賴性。

在用針刺法對腦卒中痙攣的治療中，患者痙攣狀態得到顯著緩解，而其脊髓液中γ-氨基丁酸也顯著增加，推測針刺法通過刺激患者體內γ-氨基丁酸分泌，從而對肌肉痙攣進行抑制[8]。甘氨酸是腦干和脊髓抑制性中間神經元的遞質，但與γ-氨基丁酸不同的是，甘氨酸屬于突觸后抑制，無法對突觸前抑制進行調節。甘氨酸及其前體物質具有增強運動反射突觸后抑制的作用，如果采用抑制劑對甘氨酸受體物質進行拮抗，則會引起強烈的痙攣反應[9]。在本實驗中，痙攣模型大鼠內囊中γ-氨基丁酸和甘氨酸的含量均顯著低于對照組和假手術組。而給模型大鼠灌胃藥液后，其內囊中的γ-氨基丁酸和甘氨酸含量顯著增加，而增加量呈現出對藥物濃度的依賴性。在1.0 g/100 g以上的給藥量時，痙攣大鼠內囊中的γ-氨基丁酸和甘氨酸含量與正常對照組和假手術組比較差異無統計學意義，說明芍甘木瓜湯可以通過提高大鼠內囊中γ-氨基丁酸和甘氨酸的含量來抑制痙攣模型大鼠的肌痙攣。

實驗結果顯示，腦卒中痙攣模型大鼠內囊中的天門冬氨酸和谷氨酸含量顯著高于對照組和假手術組，而灌胃芍甘木瓜藥液后則顯著降低，并且灌胃劑量為1.5 g/100 g時，與對照組和假手術組比較差異無統計學意義。說明芍甘木瓜湯能通過降低痙攣模型大鼠內囊興奮性氨基酸神經遞質含量，使腦受損后的中樞神經系統氨基酸代謝恢復平衡狀態，緩解由于興奮性氨基酸神經遞質造成的肌肉痙攣狀態。

研究表明，腦卒中模型大鼠腦組織中的單胺類神經遞質顯著降低，腦卒中患者腦脊液中的單胺類神經遞質也是顯著降低的[10]。在本實驗中，腦卒中痙攣模型大鼠內囊中的5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素等單胺類神經遞質顯著低于對照組和假手術組，說明模型大鼠的中樞抑制作用顯著下降，從而造成模型大鼠的肌張力提高。而在給模型大鼠灌胃芍甘木瓜湯后，5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素含量則顯著提高，說明芍甘木瓜湯對腦卒中痙攣大鼠肌痙攣的治療作用也與提高其中樞神經系統中單胺類的神經遞質有關。

4 結論

偏癱肢體肌痙攣是腦卒中患者術后恢復常見的后遺癥，與腦受損后神經遞質代謝的異常具有密切的相關性。本實驗中，芍甘木瓜湯具有滋肝、舒筋、鎮痛、活血、下行的藥效。對腦卒中痙攣大鼠模型灌胃的研究表明，該藥方可以通過改善腦受損后中樞神經系統中神經遞質的代謝，抑制肌張力的提高，能有效緩解因腦卒中造成的肌痙攣現象。