TLR4/MyD88介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在體外培養(yǎng)癲癇海馬組織中的作用研究

葉潔梅， 黃國(guó)雄， 黃媛恒

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病。近年來(lái)，癲癇與免疫相關(guān)的學(xué)說(shuō)漸漸倍受關(guān)注，異常免疫反應(yīng)可能是癇性發(fā)作和癲癇形成的始動(dòng)因素之一，小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元可作為免疫活性細(xì)胞，參與和影響炎癥反應(yīng)。天然免疫受體Toll樣受體家族(Toll-like receptors,TLRs)是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，TLR4(toll-like receptor 4)作為TLRs家族的一名重要成員，是神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性受體，可以促進(jìn)免疫調(diào)控分子和細(xì)胞因子表達(dá)，影響癲癇的發(fā)生和進(jìn)展，具體作用尚不十分清楚[1]。本研究擬體外觀察大鼠海馬癲癇組織中細(xì)胞TLR4介導(dǎo)的炎癥效應(yīng)和作用通路，進(jìn)一步闡明癲癇發(fā)病中的炎癥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器 新生6～9 d SD鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限。HBSS購(gòu)于Sigma公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)于Invitrogen，SYBR Green Supermix試劑盒購(gòu)于Bio-Rad公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司，Anti-MyD88購(gòu)于Bioss公司，TLR4 Polyclonal Antibody購(gòu)于Abbkine公司，Western blotting DAB顯色試劑盒購(gòu)于Solarbio公司。實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)于Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 體外自發(fā)性癲癇樣放電海馬腦片模型制備 無(wú)菌條件下分離出新生6～9 d SD鼠的完整海馬，置于4 ℃HBSS液中，在振動(dòng)切片機(jī)的載物平臺(tái)上，以400 μm厚度進(jìn)行切片。隨后將海馬腦片放在6孔培養(yǎng)板各孔內(nèi)的濾膜上，各孔內(nèi)分別加入1.3～1.5 ml的完全培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每周半量更換培養(yǎng)液兩次，倒置相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)至7 d。人工腦脊液(ACSF)成分(mmol/L)：NaCI 124、KCI 3.3、KH2PO41.2、NaHCO326、CaCl22.5、MgSO42.4、葡萄糖10，pH 7.4。腦片在ACSF中通95%O2及5%CO2孵育至少1 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)改用未加Mg2+ACSF(即無(wú)Mg2+ACSF)灌流3 h，制備自發(fā)性癲癇樣放電海馬腦片模型，于造模前和造模后1 d、3 d、1 w各時(shí)點(diǎn)收集樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)TLR4、MyD88、IL-1β、IL-6基因 于造模前和造模后1 d、3 d、1 w各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收取組織標(biāo)本，冰上碾磨，提取海馬組織總RNA，紫外分光光度計(jì)鑒定純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用SYBR Green核酸熒光染料，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作，進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)后分析結(jié)果，采用公式2-△△CT計(jì)算各目的基因mRNA的表達(dá)水平。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測(cè)TLR4和信號(hào)蛋白MyD88的表達(dá) 于造模前后1 d、3 d、1 w各時(shí)點(diǎn)，采用蛋白提取試劑盒按說(shuō)明書操作提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后煮沸變性，SDS-PAGE 凝膠電泳，70 V電轉(zhuǎn)4 h至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加入稀釋后的待檢測(cè)的蛋白單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗，室溫1 h，洗膜3次，每次10 min，顯色曝光，分析TLR4和MyD88的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬腦片中TLR4 mRNA和蛋白的比較 和造模前大鼠正常海馬組織對(duì)照組相比，造模后1 d、3 d、1 w大鼠癲癇樣放電海馬腦片中TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均明顯增高(P<0.001)，TLR4 蛋白的表達(dá)水平也均明顯增高(P<0.001)(見圖1A、1B)。

2.2 大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬腦片中MyD88 mRNA和蛋白的比較 和造模前大鼠正常海馬組織對(duì)照組相比，造模后1 d、3 d、1 w癲癇樣放電海馬腦片中各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組MyD88 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均明顯增高(P<0.001)，MyD88蛋白的表達(dá)水平也均明顯增高(P<0.001)(見圖2A、2B)。

2.3 大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬腦片中IL-1β和IL-6 mRNA的比較 和造模前大鼠正常海馬組織對(duì)照組相比，造模后1 d、3 d、1 w癲癇樣放電海馬腦片中各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組IL-1β和IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均明顯增高(P<0.001)(見圖3A、3B)。

(注：***P<0.001)

圖1 A：大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬中TLR4 mRNA水平；B：大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬中TLR4蛋白表達(dá)

(注：***P<0.001)

圖2 A：大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬中MyD88 mRNA水平；B：大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬中MyD88蛋白表達(dá)

(注：***P<0.001) (注：***P<0.001) 圖3 A：大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬中IL-1β mRNA水平；B：大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬中IL-1β蛋白表達(dá)

3 討 論

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病，流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率為5‰～7‰。由于血腦屏障的存在及腦內(nèi)缺乏淋巴系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)曾被認(rèn)為是免疫豁免的場(chǎng)所，癲癇曾被認(rèn)為是非炎癥性病變。近年來(lái)，大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)表明，腦部炎癥反應(yīng)是癇性發(fā)作和癲癇形成的重要機(jī)制之一，癲癇發(fā)作后快速誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和外周免疫細(xì)胞的活化以及炎癥細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)，炎癥也可誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，促進(jìn)其病理進(jìn)程，并導(dǎo)致海馬發(fā)生病理性改變，例如局部神經(jīng)元損傷凋亡、膠質(zhì)細(xì)胞修復(fù)再生等[1～3]。

TLRs家族中的TLR4可被體內(nèi)受損細(xì)胞釋放的內(nèi)源性配體如熱休克蛋白、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、高遷移率組蛋白1 (high mobility group box 1 protein，HMGB1)激活，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[4]。MyD88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR4的胞內(nèi)接頭蛋白，具有募集下游信號(hào)分子的N端死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)和承接TLRs活化信號(hào)的C端TIR結(jié)構(gòu)域。TLR4與細(xì)胞內(nèi)源性配體激活后，通過(guò)C端TIR結(jié)構(gòu)域募集MyD88樣接頭蛋白MAL(MyD88 adaptor like protein，MAL)和MyD88，與IRAK(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK) 家族分子結(jié)合成為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，隨后后者磷酸化從MyD88/IRAK復(fù)合體脫離，激活接頭蛋白TNF受體相關(guān)因子(TNFR-associationfactor-6,TRAF-6)，促使NF-κB由胞漿轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，激活 IL-1β、IL-8、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、補(bǔ)體、趨化因子等基因，最終導(dǎo)致炎癥因子釋放[5,6]。

TLR4在腦組織中主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于TLR4及其信號(hào)通路與癲癇關(guān)系的研究較少。Das等[7]在大鼠出生后2 w給予注射LPS后發(fā)現(xiàn)激活的TLR4可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并且這些大鼠成年后對(duì)癲癇的易感性增加。Rodger等[8]對(duì)大鼠腦皮質(zhì)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LPS與TLR4 結(jié)合后可引發(fā)局部癲癇樣放電。Maroso等[9]發(fā)現(xiàn)TLR4在海人藻酸致癇小鼠的CA1、CA3、DG 區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上表達(dá)增多，TLR4基因敲除或TLR4拮抗劑處理后小鼠癇性發(fā)作減輕。體外培養(yǎng)新生SD大鼠海馬神經(jīng)元無(wú)鎂細(xì)胞外液所致難治性癲癇模型中TLR4蛋白及mRNA增高，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠癲癇樣放電海馬組織中，TLR4和MyD88的mRNA和蛋白的均不同程度的升高，炎性因子IL-1β和IL-8 mRNA升高，表明TLR4/MyD88信號(hào)通路在癲癇發(fā)病和進(jìn)展的炎癥反應(yīng)中起重要作用。

綜上所述，本研究表明，癲癇海馬內(nèi)細(xì)胞表面表達(dá)的TLR4可作為重要的受體，通過(guò)MyD88介導(dǎo)神經(jīng)炎性損傷，可能是癲癇形成的異常免疫機(jī)制之一，免疫調(diào)節(jié)和抗炎治療可能是癲癇治療的新靶點(diǎn)。