食源性蛋白酶抑制劑結構與功能

張允萍，吳子健，李丹陽

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

蛋白酶抑制劑（protease inhibitor，PI）是一類對蛋白酶的活性具有抑制作用的多肽或蛋白質的總稱。其來源廣泛，特別是源自食品或食材中的PI 不僅具有調節機體蛋白酶活性的作用，進而調節生物機體的代謝活動[1-15]；同時也具有抗腫瘤、調節機體免疫力等諸多有益于人類健康的功能。研究與闡述這些食源性蛋白酶抑制劑（foodborne protease inhibitor，FPI）的結構與功能特點對于進一步開發與利用這些FPI 具有十分重要的意義。

1 食源性蛋白酶抑制劑的來源及其分類

天然食源性PI 分布十分廣泛，多累積并存在于食源性植物的塊莖、種子、葉子以及果實等組織中[16]。目前豆科（Fabaceae）、禾本科（Poaceae）和茄科（Solanaceae）等是PI 主要來源，例如豆科類植物中的大豆、鷹嘴豆、木豆、豌豆以及花生等；禾本科植物中的大麥、小麥、小米、玉米、蕎麥、水稻以及高粱等；茄科類植物中的番茄、馬鈴薯和煙草等；葫蘆科中的南瓜；以及鳳梨科中的菠蘿。其中豆科類植物種子中的PI 占其總蛋白含量的6%；禾本科類的谷物蛋白中PI 約占10%；隨著探尋PI 范圍的擴大，研究者還從錦葵科（Malvaceae）、蕓香科（Rutaceae）、辣木科（Moringaceae）、桑科（Moraceae）、天南星科（Araceae）和番木瓜科（Caricacea）等類的植物體發現了相應的食源性的PI。

2 蛋白酶抑制劑的作用機理

PI 之所以能夠有效地抑制蛋白酶（或稱為PI 的靶酶）的酶解活性，主要原因如下：（1）PI 與靶酶相互作用時，兩者之間就如酶和底物之間的相互作用形式一樣，在共價鍵以及其他次級鍵（如：氫鍵、疏水相互作用等）的作用下，抑制劑上暴露在外的抑制活性中心與靶酶上的酶解活性中心相互接近并結合，最終導致共價或者非共價型“蛋白酶抑制劑-蛋白酶復合物”的形成；（2）PI 與靶酶之間反應的米氏常數很低，導致其與靶酶的親和力比普通底物與靶酶之間的親和力大很多，因而會使得PI 要優先于普通蛋白底物與靶酶迅速結合并形成復合物；（3）但是與通常的酶催化反應相比，PI 與靶酶結合后，抑制劑上與靶酶結合的活性中心肽鏈的裂解速度極慢甚至并不裂解[17]，從而閉鎖了靶酶的活性中心，使靶酶無法再與其他蛋白底物結合，導致其酶解活性的喪失。

3 蛋白酶抑制劑的分類與結構特點

PI 通常是按照其本身的結構、生物化學性質、或其作用靶酶的特異性等來進行分類的。根據所抑制靶酶的特異性，PI 可分為胰蛋白酶抑制劑、胰凝乳蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶抑制劑等[18]；根據結構功能和生物化學特性（包括PI 中活性位點的構成、抑制劑蛋白一級結構中二硫鍵的存在與否、抑制劑與靶酶間的抑制作用機制、抑制劑蛋白的三維結構、以及在熱激條件或洗滌劑存在時抑制劑的穩定性），PI 也可以分為Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑（Bowman-Birk-type protease inhibitor，BBPI）、Kunitz 型蛋白酶抑制劑（Kunitztype protease inhibitor，KuPI）、Kazal 型蛋白酶抑制劑（Kazal-type protease inhibitor，KaPI）等[18]。

3.1 Bowman-Birk型蛋白酶抑制劑

BBPI 是一類能夠抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶活作用的PI，是由Bowman 于1946年從大豆中首次發現，Birk 等于1963年對該類蛋白酶抑制劑的性質與結構進行深入研究，因此兩人的名字來命名Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑，該類蛋白酶抑制的分子量通常為8 kDa～17 kDa。該類PI 擁有兩個同源重復的結構域，各自含有一個通過二硫鍵鎖扣而形成的表面環區，如圖1所示的源自大豆的BBPI，其含有兩個P1 環區，即“9 殘基-二硫鍵-環區”（nine-residue disulfide loop），兩個環區上的β-折疊短鏈會直接與所抑制的蛋白酶以非共價形式相互作用，形成“蛋白酶-抑制劑復合物”[19]。BBPI 對蛋白酶的抑制作用符合Laskowski機制：當抑制劑以底物與酶相互作用的方式和酶結合時，兩個表面環區上各自有一個剛性肽鍵能夠有效抑制蛋白酶的活性，表現為在pH 值中性條件下，抑制劑與蛋白酶相互作用時，催化常數與米氏常數之間的比值（即 kcat/Km）很大，而兩者（kcat和 Km）各自卻很小。這類抑制劑不僅可抑制S1 家族蛋白酶，也可抑制部分S3 家族蛋白酶。

BBPI 多見于豆科或禾本科植物的種子中，常按其來源來命名。目前這些抑制劑蛋白三維結構研究非常透徹的有：向日葵環狀抑制劑（sunflower cyclic inhibitor）、大豆抑制劑（soybean inhibitor）、大麥種子抑制劑（barley seed inhibitor）、小麥胚芽抑制劑（wheat germ inhibitor）、豌豆種子抑制劑（pea seed inhibitor）和花生抑制劑（peanut inhibitor）。這些BBPI 分子的結構十分相似，氨基酸殘基序列上也具有高度同源性[20]。以源自大豆的BBPI 結構（如圖1所示）為例來說明，大豆BBPI 分子由71個氨基酸殘基構成，其中14個為半胱氨酸殘基，且兩兩配對形成二硫鍵[16]，使得BBPI 具有十分緊密交聯共價結構，而正是這些二硫鍵以及肽鏈內的氫鍵使得大豆BBPI 分子形成了兩個對稱三環區域（tri-cyclic domain）（如圖1所示），每個區域中都有一個由9個氨基酸殘基構成的典型環區部位，在抑制蛋白酶活力時，這兩個環區會與蛋白酶結合，而環口處的兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵會鎖扣住環區部分，該環區含兩個抑制位點[21]，即Lys16 處抑制胰蛋白酶，Leu44 處抑制胰凝乳蛋白酶[22]。1997年 Ware 等發現BBPI 對胰凝乳蛋白酶的抑制作用強于其對胰蛋白酶[23]；發生抑制作用時，BBPI 與胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶按照分子個數比1∶1 比例結合，或同時與兩種酶結合共同形成“酶-抑制劑復合物”[22]。

圖1 大豆BBPI型蛋白酶抑制劑的-級結構序列Fig.1 Primary structure of soybean Bowman-Birk protease inhibitor

3.2 Kunitz型蛋白酶抑制劑

Kunitz 型蛋白酶抑制劑（Kunitz-type protease inhibitor，KuPI）是另一種來源廣泛的 PI，豆科類植物的KuPI 含量最為豐富，特別是含羞草亞科（Mimosoideae）、蝶形花亞科（Papilionoideae）及云實亞科（Caesalpinioideae）[24]。KuPI 可特異性抑制蛋白酶，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等[25]，通常分子量約為18 kDa～22 kDa[26]，含 170個～200個氨基酸殘基，由一條或兩條多肽鏈組成；KuPI 中的半胱氨酸殘基數量較少（不超過 4個），通常為 4個、2個或 1個半胱氨酸殘基，甚至是沒有半胱氨酸殘基[24]，所形成的鏈內二硫鍵雖然少或沒有，但分子的構象以及活性區域都十分穩定[27]，可能這些KuPI 分子不是靠二硫鍵而是依靠氫鍵等其他非共價作用力來穩定構象。KuPI 分子與胰蛋白酶結合位點往往含有特別適合與胰蛋白酶活性位點相互作用的堿性殘基，如Lys 或Arg，而且大部分KuPI 分子可與其靶酶按分子個數比為1∶1 的比例形成“蛋白酶-KuPI 復合物”[28-29]，也有一些KuPI 分子含有第二個獨立的反應位點[30]，如刺桐抑制劑（Eritrina variegate inhibitor）可與胰凝乳蛋白酶以分子個數比為1∶2 比例結合形成“酶-KuPI-酶復合物”復合物[31]。

通常在構成分子的多肽鏈以及二硫鍵的數量方面，KuPI 又有若干種情況，例如：1）蝶形花亞科（Papilionoideae）及云實亞科（Caesalpinioideae）的 KuPI 抑制劑多為單亞基蛋白，含一條多肽鏈，如蝶形花亞科正因加豆的胰蛋白酶抑制劑（Inga laurina trypsin inhibitor，INTI），分子量為 20 kDa，含一條肽鏈和一個二硫鍵，對胰蛋白酶有抑制作用而對胰凝乳蛋白酶并無抑制，同時其延續了抑制劑的高穩定性——即在高溫短時的情況下仍能保持其活力，而在pH=2.0～10.0 區間擁有很高的耐受性[32]；2）含羞草亞科（Mimosoideae）的KuPI 為二聚體蛋白，含兩條多肽鏈[33]，如：金合歡蛋白酶抑制劑（Acacia confuse trypsin inhibitor，ACTI）由兩條肽鏈組成，A 鏈和B 鏈通過鏈內的二硫鍵相連，其一級結構如圖2示；ACTI 含有175個氨基酸殘基，其中A 鏈含有136個殘基，B 鏈含有39個殘基，擁有4個半胱氨酸殘基這4個半胱氨酸殘基形成2個保守的二硫鍵[34]；3）菝葜紫荊半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Bauhiniabauhinioides cysteineproteaseinhibitor，BBCPI）為18 kDa 的中性蛋白，含164個氨基酸殘基，不含蛋氨酸即甲硫氨酸，也不含半胱氨酸，因此不能形成二硫鍵，但同樣耐熱耐堿，可能氫鍵對構象的穩定起到至關重要的作用[35]。

大豆中的Kunitz 型蛋白酶抑制劑最早由Kunitz于1947年發現并結晶得到[36-37]，目前該蛋白的結構研究最為透徹，該分子由181個氨基酸殘基構成（如圖2），含兩個二硫鍵（Cys39-Cys86和 Cys136-Cys145），其一級結構如圖2所示[38-39]。整個分子的空間構象為一個完整的球狀，直徑為3 nm～5 nm[39-40]，其規正的二級結構是由12 條反平行β-折疊鏈（相互之間由無規則環區分隔）構成，其中6 條折疊鏈構成一個三維對稱的反平行β-桶），而另外6 條折疊鏈以三維對稱方式構成反平行β-桶的上蓋，β-桶的底部是蛋白中的環區部分構成，其中包括氨基端長的環區和羧基端，而且這個有環區構成的底部還含有活性位點（Arg63-Ile64處[41]）。

3.3 Kazal型蛋白酶抑制劑

Kazal 型蛋白酶抑制劑（Kazal-type protease inhibitor，KaPI）是一種主要分布于動物組織或禽類卵清中的PI，其名稱來源于該類PI 最早發現者Kazal（其于1948年首次發現并鑒定了KaPI）。KaPI 分子通常含有一個或多個特異性的Kazal 結構域，典型的Kazal 結構域的特點（如圖3所示）包括：1）通常由 40個～60個氨基酸殘基構成[42]；2）其通用的氨基酸殘基序列為CXa-C-Xb-P-V-C-G-Xc-Y-Xd-C-Xe-C-Xf-C，其中的下標 a、b、c、d、e 和 f 都是氨基酸殘基整數倍數字；3）含有6個高度保守的半胱氨酸殘基，并形成3個域內二硫鍵（1-5、2-4、3-6）[43]；4）空間結構上，3 股相鄰折疊鏈形成的β-片層與若干肽片段環區共同環繞著1 股α-螺旋；5）Kazal 結構域中有 3個結構域，分別為 A 結構域、B 結構域以及C 結構域（如圖3所示），其中B結構域為反應位點環，其含有決定其抑制特異性的P1氨基酸殘基以及易剪切肽鍵，凸起的B 環為KaPI 與相關蛋白酶的契合并形成“KaPI-蛋白酶”復合物提供了便利的接觸位點[44]。通常脊椎動物的KaPI 為典型的KaPI，因為其分子所含的結構域是典型的Kazal 結構域，而無脊椎動物KaPI 是另一種非典型的KaPI 分子，其與典型的KaPI 的主要區別在于：1）抑制劑分子中所含的非典型Kazal 型結構域相對較多，例如：櫛孔扇貝（Zhikong scallop Chlamys farreri）的Kazal 型蛋白酶抑制劑擁有12個結構域是目前發現含有結構域最多的Kazal 型蛋白酶抑制劑[45]；2）各結構域的氨基酸殘基個數相對較少；3）結構域內的半胱氨酸殘基數目不同；4）一級序列上相鄰的半胱氨酸殘基間的氨基酸殘基數目和種類有差異。當然，上述的差異，特別是后3 種的差異，并不能影響各Kazal 結構域的三維空間結構的相似性。

圖3 脊椎動物與無脊椎動物Kazal型蛋白酶抑制劑的結構比較Fig.3 Structural comparison of vertebrate and invertebrate Kazal-type protease inhibitors

KaPI 的作用原理也是符合Laskowski 機制，當KaPI 與蛋白酶作用時，P1位點的氨基酸殘基的側鏈可完全契入蛋白酶活性位點（也稱為S1 腔）內，同時分子中Kazal 結構域共有12個接觸位點（分別為P6、P5、P4、P3、P2、P1、P1′、P2′、P3′、P14′、P15′以及 P18′）可與蛋白酶接觸。抑制劑分子通過非共價鍵與蛋白酶形成“蛋白酶-KaPI”復合物，并且兩者之間的締合系數非常高，導致KaPI 對蛋白酶的抑制作用非常強烈和緊密，另一個方面，KaPI 分子對蛋白酶抑制特異性主要是由B 環上的P1位點（位于第二個半胱氨酸殘基后的第二個氨基酸位置上[46]）的氨基酸殘基決定（如表1），而其它11個與蛋白酶接觸氨基酸殘基會有效影響結合效力以及抑制活力。

表1 P1位點氨基酸殘基與其對應抑制的蛋白酶種類Table 1 Amino acid residues at P1 position and their corresponding inhibitory protease species

KaPI 通常有多個Kazal 結構域，且結構域之間有一些差異，一般每個獨立結構域都有其特殊的活性位點，可獨立作用并抑制相應的蛋白酶活性，因而一種KaPI 可同時抑制多種蛋白酶，甚至是不同類型的蛋白酶。另外，KaPI 分子中的各Kazal 結構域鏈接鍵相對比較靈活，以至于各結構域之間不會有空間位阻，例如火雞（turkey）卵類黏蛋白中的3個結構域可分別抑制不同的蛋白酶：結構域1 可抑制灰質葡聚糖蛋白酶；結構域2 可抑制胰蛋白酶，結構域3 可抑制胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶或者枯草芽孢桿菌蛋白酶[47]。但也有例外存在，一些結構域在空間結構上十分符合Kazal 型結構域的特質，但是它們對蛋白酶并無抑制活性，例如：源自角鯨（P.monodon）的Kazal 型蛋白酶抑制劑SPIPm2 上的Kazal 結構域2 中的P1位點為蘇氨酸殘基，不能抑制胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶；源自羅氏沼蝦和長紅獵蝽的MRPINK 和Rhodinin 的P1位點為亮氨酸殘基和甘氨酸殘基，然而此域亦無活性。

4 食源性蛋白酶抑制劑的功能

FPI 廣泛來源于食源性的動植物以及微生物機體或細胞中，它們不僅能在機體內與各自所抑制的靶酶相互制約并共同作用，來調節機體的生長發育，甚至是抵抗外來的病蟲害等不利因素。其功能與生理作用具有多樣性。

4.1 蛋白酶活性的調節功能

PI 與內源性靶酶共存于同一個有機體中[18]，抑制劑對蛋白酶的活性具有重要的調節功能。例如，植物種子中所貯存的蛋白質是供給未來其萌發所需的氮源，同時種子中存在的抑制劑可有效地控制蛋白酶水解這些貯存蛋白質的進程，既確保了在萌發過程中氮源的持續供應，又預防了各種蛋白酶對種子或幼苗機體不利或無效的水解[48]。

4.2 貯藏蛋白的功能

PI 在動植物以及微生物機體中含量十分豐富，它們既作為水解蛋白的工具，同時其本身也是有用的貯藏蛋白。在機體（無論是禽卵還是植物種子）生長發育過程中，這些PI 也能夠被降解，進而緩慢釋放出氮源和碳源為機體的生理活動供能[49]。例如，大豆和綠豆種子的PI 含量占總蛋白質的6%～8%；大麥種子的PI含量占總蛋白質的10%；可可種子中的蛋白酶抑制含量可以達到25%～30%[48]。這些種子萌發過程中，都可以檢測到PI 的含量在機體中顯著降低。

4.3 抗發炎和抗腫瘤作用

植物來源的Bowman-Birk 和Kunitz 的PI 具有抗炎和抗腫瘤作用[50-52]。通常認為PI 可阻止細胞基質過氧化的發生，因而減少免疫細胞釋放氧自由基的可能，進而避免了機體細胞磷脂膜遭受過氧化的破壞，不僅能有效降低多形核白細胞的增殖，而且也能防止了由多種蛋白酶所引發的機體炎癥反應的產生[53]。例如：2005年Park 等研究表明：BBPI 可有效抑制小鼠肺部或胃腸道腫瘤，以及大鼠食管瘤、倉鼠口腔癌細胞及小鼠淋巴瘤的增長[54]；中國黑大豆的Kunitz 型抑制劑可抑制乳腺癌細胞MCF-7 和肝癌細胞HepG2 的增殖[55]；正因加豆的 Kunitz 抑制劑（Inga Vera trypsin inhibitor，IVTI）可降低 Caco-2 細胞的增殖[6]；大豆中的BBPI 可以保護胃腸道，阻止癌癥的惡化。2014年Arques 等的研究發現BBPI 還可有效抑制或預防由輻射/化學致癌物誘發的機體癌變[56]。另外，2004年Kobayashi等的研究[57]發現大豆中的PI 可穩定晚期卵巢癌病人的病情，其可能的原因是在于大豆的PI 能在基因層面以及蛋白表達水平上下調尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，UPA）以及尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活物受體（urokinasetype plasminogen activator receptor，UPAR）。

BBPI 分子內部的二硫鍵能夠強有力地保障其結構的穩定性，從而保證了其穩定的蛋白酶抑制活性，所以BBPI 分子可耐受機體胃內的酸性環境，以及胃和小腸中酸性蛋白酶或胰酶等的作用，同時BBPI 還可免受機體腸道微生物菌群酶系的作用及其代謝反應過程。通常這些BBPI 分子可以歷經機體消化道的作用，在進入機體大腸部位后仍能保留活性，發揮抗癌和抗發炎的功能。BBPI 作用可使得人體結腸癌細胞HT29 多數處于細胞周期的G0 期和G1 期，從而有效抑制了HT29 細胞的增殖[53]。只有在高溫滅活的情況下，結構受到了嚴重的破壞，BBPI 才會失去其抗癌抗發炎的作用。

4.4 抗凝血、抗菌、抗病毒作用

某些PI 甚至對凝血因子有抑制作用，對腫瘤細胞黏附有阻礙作用，對炎癥現象也有抑制作用，因而開發出了以PI 為原料的抗凝血劑。BBPI 還具有抗菌、抗病毒的作用。2001年Ye 等研究發現[58]蠶豆中分離了分子質量為7.5kDa 的Bowman-Birk 型抑制劑，可抑制HIV-1 反轉錄酶活性，對鼠的脾細胞具有促進增殖的作用同時還具有抗菌作用。分布在巴西自北至南潮濕地區的正因加豆屬于豆科植物的含羞草（Mimosoideae）亞科，它的種子中提取的Kunitz 型抑制劑（Inga Vera Trypsin Inhibitor，IVTI）可以抑制真菌和白色念珠菌，也抑制致病細菌，如大腸桿菌[6]。此外，在A549 細胞中發現的PI 除了具有抗氧化和抗腫瘤的能力以外，還有預防由氧化應激引起的疾病的能力。由此，推斷PI 可以與常規藥物一起用作補充劑，以增加治療心血管疾病、動脈粥樣硬化和癌癥等疾病的功效[59]。Kunitz 型抑制劑就是被重點開發的一種PI，從這些抑制劑分離純化出來的低分子質量的化合物可以設計為涉及蛋白水解過程的檢測或治療的工具[26]。

4.5 預防肥胖作用

在對PI 進一步的深入研究中發現：通過體內大鼠實驗表明，來自羅望子種子Kunitz 型蛋白酶抑制劑可以減少體重的增長，并增加血漿膽囊收縮素水平[60]，因此有希望成為預防和治療肥胖的一款植源性提取物。

5 結論與展望

食源性蛋白酶抑制劑來源廣泛，種類繁多，功能多樣，不僅是生物機體的調節劑，同時還可以發揮抗腫瘤、調節免疫力等多種生理作用。它們擁有能抑制多種酶的生物活性，且不同的FPI 活性和作用的酶也不同。研究不同來源的FPI 的性質和藥理作用，開展臨床研究，可以開發出療效更好的新藥。利用FPI 獨特的結構特點與生物活性在醫學上將有更加廣泛的應用。