酒曲中產香霉菌的篩選及其培養條件優化

朱莉莉，黃治國，衛春會，鄧杰，謝軍

（四川理工學院，釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000）

中國白酒是以曲類、酒母為糖化發酵劑，利用淀粉質（糖質）原料，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾、陳釀和勾兌而釀制而成，酒質無色（或微黃）透明，氣味芳香純正，入口綿甜爽凈，酒精含量較高，經貯存老熟后，具有以酯類為主體的復合香味[1-3]。作為發酵的動力，糖化發酵劑的質量直接關系到酒的質量和產量。從20世紀80年代起，有關白酒微生物的研究進入了高潮，從酒廠、科研機構到學校都在做有關白酒微生物的研究，酒曲微生物功能的研究仍主要集中于產香微生物，常采用生化平皿和酯化酶活力的方法對產香微生物進行篩選[4-6]，并通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS）分析和產酶條件分析來準確反映微生物的代謝機理及特性，主要包括酵母、霉菌和細菌等[7-8]。吳衍庸深入研究了酒曲微生物和中國白酒香型的關系，他認為酒曲的質量對其中微生物功能的發揮影響很大[9]；云敏等從醬香型酒曲中篩選的霉菌用于純種培養制曲，通過感觀和理化分析，初步得出紅曲霉菌株的代謝產物是醬酒風味物質主要來源[10]；陳曉春等研究了根霉酯化酶與酒香形成的關系，研究表明酯化酶制劑具有較高的酯化能力，通過提高白酒里乙酸乙酯、己酸乙酯等能夠形成酒香的主要成分的含量，明顯改善了白酒香型與品質[11]；王邦坤等通過大量的試驗證明，采用產香霉菌接種曲藥，可以明顯提高大曲的質量[12]。本文對來源于酒曲中的霉菌進行篩選，以獲得一株產香能力強的菌株，對其生長條件進行優化，為豐富釀酒微生物菌種資源庫、提高酒曲質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從大曲、小曲及麩曲等酒曲中篩選得到的25 株霉菌，由釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室保存。

1.2 主要試劑與配制

主要試劑：氫氧化鈉、硫酸、無水乙醇、酚酞、瓊脂、蔗糖、氫氧化鉀、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、碳酸鈉：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

試劑的配制：0.9%生理鹽水、乳酸-石碳酸-棉藍染液、1%酚酞指示劑、溴甲酚綠-甲基紅指示液等[6，13]。

培養基的制備：馬鈴薯固體培養基（potato dextrose agar,PDA）、PDA 液體培養基、產酯化酶初篩培養基、產酯化酶復篩培養基[14-16]。

1.3 主要儀器設備

超凈操作臺（SW-CJ-2D）：蘇潔凈化設備有限公司；智能生化培養箱（LHR）：上海齊欣科學儀器有限公司；恒溫培養振蕩器（ZHWY-103D）：上海智城分析儀器制造有限公司；菌落分析儀（Scan1200）：Inter science公司；電子分析天平（BS224S）：塞多利斯科學儀器北京有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 霉菌的分離活化

將實驗室保存的霉菌菌株接種到PDA 平板培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱中培養72 h，進行活化。將活化后的霉菌用平板劃線的方法分離出單菌落，挑取單菌落接種于PDA 斜面培養基，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.4.2 產香霉菌的初篩

取活化后的霉菌接種到平板篩選培養基上，30 ℃培養72 h，觀察菌落周圍產生透明圈的情況，若產透明圈則表明霉菌具有產酯化酶能力，透明圈越大則產生的酯化酶水解能力越強[17-18]。

1.4.3 產香霉菌的復篩

以透明圈平均直徑（D，mm）與菌落平均直徑（d，mm）之比（D/d）＞1.5 為復篩條件選擇菌株制成菌懸液[19]，取2 mL 的菌懸液加入裝有100 mL 產酯化酶復篩培養基的 250 mL 錐形瓶中，于 32 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養4 d，培養液經6 000 r/min 離心20 min 去沉淀，上清液即為酶液，置于4 ℃冰箱中留存備用[17]；取己酸1.5 mL 于250 mL 錐形瓶中，加25 mL 無水乙醇，稍微振蕩后，加入75 mL 蒸餾水，充分混勻。再加入0.2 mL酶液加到錐形瓶中，搖勻后，用塞子塞上，密封，置于35 ℃恒溫箱內保溫酯化24 h，同時做平行試驗和空白試驗，并采用皂化回流法測定總酯含量[20]。

1.4.4 菌株生長特性單因素試驗設計

單因素水平設計表見表1。

表1 單因素水平設計表Table 1 The design of single factors

以溫度、pH 值、耗氧量為因素設計單因素試驗，在試驗過程中，當單一因素變化時，其它因素都以有底紋的數據作為參數，研究單一因素變化對菌株生長質的影響。試驗通過菌絲體干重法進行檢測，即將培養結束的菌液，裝入離心管中，用蒸餾水將錐形瓶洗滌3 次，將洗滌液一并倒入離心管中，在6 000 r/min 下，離心20 min，去除上清液，在105 ℃下烘干至恒重，并稱其干重[15]。

1.4.5 菌株生長特性正交試驗設計

正交試驗L9（34）因素水平表見表2。

表2 正交水平表Table 2 Level of orthogonal table

根據單因素試驗結果，采用L9（34）正交表對溫度，pH 值，耗氧量等培養條件進行優化，試驗各因素設計3個水平。

2 結果與分析

2.1 產香霉菌的篩選

2.1.1 初篩

初篩結果見表3。

將實驗室保存的25 株霉菌接種到產香篩選培養基上培養，經觀察，出現透明圈的菌株有M23、M31、M34、M35、M40、M43、M51、M57 共 8 株菌株，以 D/d＞1.5 為復篩條件，選擇 M23、M32、M35、M57 作為復篩出發菌株。

2.1.2 復篩

復篩結果見表4。

將初篩獲得的8 株霉菌接種到產酯培養基中，32 ℃發酵4 d 后，通過皂化回流法測得的各菌株相對應的總酯的含量（以己酸乙酯計），從表4中可以看出，在相同的條件下，霉菌M23 產香能力最強，總酯含量達到1.765 g/L。篩選得到產香霉菌M23，后續將對其進行鑒定及生長特性研究。

表3 初篩菌株D/d值比較Table 3 Early screening strains D/d value comparison mm

表4 總酯含量測定結果Table 4 The total esters content in fermenting liquid g/L

2.2 菌株鑒定

M23 菌體形態圖見圖1。通過培養觀察，經1 d 后菌落初呈白色；2 d 后成灰白色，菌落較大，質地疏松；3 d 后已長出大量孢子，呈黑色。將菌種在400 倍光學顯微鏡下觀察個體形態，菌株菌絲無隔膜、有分枝和假根，營養菌絲體上產生匍匐枝，匍匐枝的節間形成特有的假根，從假根處向上叢生直立、不分枝的孢囊梗，頂端膨大形成圓形的孢子囊，囊內產生孢囊孢子。通過形態觀察和結合《真菌鑒定手冊》，初步鑒定M23為根霉屬。

圖1 M23菌體形態圖Fig.1 The morphology figure of M23

2.3 菌株生長特性

2.3.1 單因素試驗

單因素試驗結果見圖2。對M23 培養條件中的溫度、不同初始pH 值、耗氧量3個因素進行研究，研究結果表明，M23 在24 ℃～36 ℃之間均可進行不同程度的生長，在28 ℃～32 ℃之間在生長較好，最適生長溫度 30 ℃；當 pH 值高于 7.0 或低于 5.0 時，M23 菌絲生長明顯受到抑制，在pH 值為6.0 時生長最好；M23 在150 r/min 條件下菌絲量最大，轉速過低影響菌絲體分散，容易形成菌絲團，不利于菌體對營養的吸收利用，轉速過高不利于菌體生長。

圖2 單因素試驗結果Fig.2 Single-factor test results

2.3.2 正交試驗

2.3.2.1 正交試驗結果

正交試驗結果見表5，方差分析見表6。

表5 L9（34）正交試驗結果表Table 5 Fermentation conditions L9（34）orthogonal experiment results

續表5 L9（34）正交試驗結果表Continue table 5 Fermentation conditions L9（34）orthogonal experiment results

表6 方差分析Table 6 Variance analysis of the orthogonal test

影響M23 生長的培養條件的主要順序為B＞C＞A，即pH 值＞耗氧量＞培養溫度；最佳培養條件為A2B2C2，即培養溫度為30 ℃，初始pH 值為6.0，耗氧量為150 r/min；方差分析結果顯示，培養溫度和耗氧量對M23 的生長具有顯著性影響，培養基初始pH 值對其生長具有極顯著性影響。

2.3.2.2 驗證試驗

正交試驗結果表明，M23 的最佳培養條件為A2B2C2，即培養溫度為 30 ℃，初始 pH 值為 6.0，耗氧量為150 r/min，在此條件下培養所得的菌株的生長最好，與正交試驗結果最好的為第4 組A2B1C2有一定差異，因此，以正交表中結果最好的第4 組A2B1C2號為對照組進行驗證試驗。

驗證試驗結果見表7。

表7 驗證試驗表Table 7 Validation test table

研究結果發現，兩組培養條件結果相近，但方案A2B2C2菌絲干重略高于第4 組A2B1C2，所以M23 的最佳培養條件為A2B2C2，即培養溫度為30 ℃，初始pH 值為6.0，耗氧量為150 r/min。

3 結論與討論

本文以篩選于大曲、小曲及麩曲中的25 株霉菌為出發菌株，通過初篩和復篩得到了一株產香能力強的霉菌M23，總酯含量可達到1.765 g/L，初步鑒定為根霉屬。通過正交試驗結果表明，M23 這株霉菌最佳生長條件為溫度30 ℃、培養基初始為pH 值為6.0、耗氧量為150 r/min。霉菌在整個食品加工工業中的用途愈加廣泛，許多釀造發酵食品、食品原料的制造，如豆腐乳、豆豉、醬、醬油、檸檬酸等都是在霉菌的參與下生產加工出來的。在中國白酒的釀造過程中同樣具有舉足輕重的作用，霉菌通過自身代謝作用將原料中的淀粉、糖類等碳水化合物、蛋白質等含氮化合物及其它種類的化合物轉化成各種呈香呈味物質或前體物質，形成了中國白酒豐富的風味體系，促成了中國白酒獨具一格的世界地位，在后續研究中將對霉菌M23 進行深入研究并在實際生產中加以運用。