馬乳酒樣乳桿菌（XL10）的分離、鑒定及對小鼠腸道菌群的影響

賈慶喜，邢竹青，2，孫也，王艷萍，*

（1．天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2．天津中醫藥大學健康科學與工程學院，天津 300193）

開菲爾是一種由開菲爾粒發酵牛奶得到的一種傳統飲品，被認為具有多種益生和食品加工特性，如促進人體免疫調節能力、抵御疾病等。開菲爾粒[1]存在于自然界中，可用于發酵開菲爾的傳統發酵劑，是由一系列黏附在多糖-蛋白質復合物上的乳酸菌、酵母菌和部分醋酸菌所組成的復合微生物共生粒狀復合物所構成，能賦予開菲爾發酵乳所特有的口感、風味以及營養價值。開菲爾粒的菌相非常的復雜且具有相互依賴，雖然很多研究人員致力于開菲爾粒的微生物菌相分析，但始終沒有得到全面的闡明[2-3]。

馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）是從開菲爾粒（Kefir）中微生物菌相構成之一，它具有良好的發酵特性、維持腸道菌群平衡、改善腸道蠕動及機體免疫調節的功能[4-7]。本研究以西藏開菲爾粒為原料，篩選出一株馬乳酒樣乳桿菌XL10，對其進行生長特性和生物學特性研究，監測對小鼠腸道菌群結構的影響，為開菲爾粒菌相的闡明提供理論依據。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

西藏開菲爾粒：市售；細菌基因組提取試劑盒、康為土壤DNA 提取試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司；其他所有試劑均為分析純。Balb/c 雄性小鼠，體重（33±3.1）g，購自長春軍事醫學科學院實驗動物醫學研究中心。

1.2 儀器與設備

PCR 儀（5333 型）：德國 Eppendorf 公司；PCR 儀（S1000d）、熒光定量儀（CFX96 TouchO）：美國BIORAD 公司；水平電泳槽（DL-31DN）：北京東林昌盛生物技術有限公司；酶標儀（Multiskan GO）：美國Thermo公司；流式細胞儀（BD Accuri C6）：美國 BD 公司；倒置熒光顯微鏡（Nikon Ti）：日本 Nikon。

1.3 培養基

乳酸細菌培養基（mann rogosa and sharpe broth，MRS）：牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳 0.05 g，檸檬酸銨 2.0 g，吐溫 80 1.0 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL，1 mol/L NaOH 或者1 mol/L HCl 調節 pH 值至 6.2～6.4，115 ℃滅菌 15 min。固體培養基添加2%的瓊脂粉。

尿素鎂磷酸鹽（phosphate-urea-magnesium，PUM）緩沖液 （pH 7.1）：稱取 22.2 g K2HPO4·3H2O，7.26 g KH2PO4，1.8 g 尿素，0.2 g MgSO4·7H2O，蒸餾水定容至1 000 mL。121 ℃滅菌 20 min，4 ℃保存。

磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液（pH 7.4）：稱取 8 g NaCl，0.2 g KCl，3.63 g Na2HPO4·12H2O，0.24 g KH2PO4，溶于 900 mL 蒸餾水中，用鹽酸調節pH 值至7.4，加水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存。

2 試驗方法

2.1 菌株活化和分離

取少量開菲爾粒，放入無菌研缽中加入1.5 mL 滅菌生理鹽水中充分研磨，吸取勻漿1 mL 注入9 mL 滅菌生理鹽水中，10 倍度稀釋，分別涂布MRS 平板，在30 ℃厭氧條件下恒溫培養24 h～72 h，用無菌槍頭分別挑取外形顏色不同的單菌落逐一在單個MRS 平板上劃線純化，挑取單一菌落接種于MRS 液體培養基中培養48 h，進行革蘭氏染色后顯微鏡觀察和接觸酶試驗，菌株均保藏在MRS 液體培養基中，添加終濃度為25%的甘油為保護劑，-80 ℃凍存。

2.2 菌株培養

馬乳酒樣乳桿菌（Lb.kefiranofaciens XL10）充分活化，按4%接種量，接種于MRS 液體培養基中，30 ℃厭氧培養。

2.3 分離菌株16s rDNA鑒定

設計引物27F：GAGTTTGATCCTGGCTCAG 和1492R：TACCGCGGCTGCTGGCAC，以試劑盒提取的細菌全基因組為模板，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并進行序列測定，NCBI 數據庫進行序列相似性比對，并將所得序列結果上傳至NCBI Genbank 數據庫中得到唯一的序列編號。

2.4 XL10生長曲線的測定

將分離所得到的菌株接種于MRS 液體培養基中，進行30 ℃厭氧培養，每隔一定時間測定一次在600 nm波長處吸光度值，以此數據繪制出該菌株的MRS 液體培養基中，30 ℃厭氧培養的生長曲線。

2.5 細胞表面疏水性測定

細胞疏水性試驗依據Rosenberg 等[8]方法進行。將在MRS 中培養18 h 的菌體細胞（待測菌株：XL10；對照菌株：ZW3 和 CGMCC1.2161），1 000 g 離心 5 min，去上清，用PUM 緩沖液清洗兩次菌體，用PUM 緩沖溶液重懸菌體細胞，至三者起始濃度一致（2×108CFU/mL），測定此時OD600值即為Abs 前。3 mL 的重懸液與1 mL 的二甲苯在漩渦振蕩器上充分混勻，在30 ℃培養箱中孵育10 min，然后再次短暫漩渦振蕩，30 ℃培養箱中孵育10 min，進行不同相的分離。吸取水相，在600 nm 處測定吸光度值，即為Abs 后。

細胞表面疏水性/%=（G1-G2）/G1×100

式中：G1為 Abs 前；G2為 Abs 后。

2.6 細胞凝聚性測定

收集MRS 中培養18 h 的新鮮菌體細胞（待測菌株：XL10；對照菌株：ZW3 和 CGMCC1.2161），移去發酵上清液待用。用PBS 緩沖液清洗兩遍菌體，用PBS重懸菌體使三者起始濃度一致（2×108CFU/mL），測定OD600值，即為Abs 前。然后，將上述菌液在1 000 g 的條件下離心5 min，去上清，菌體沉淀用等體積相應的發酵上清重懸，混勻后，在30 ℃培養箱中靜置2 h。以培養基作為空白對照，測定上層液在600 nm 處的吸光度值，即為Abs 后。

細胞凝聚性/%=（G1-G2）/G1×100

式中：G1為 Abs 前；G2為 Abs 后。

2.7 小鼠灌胃實驗

為了研究XL10 對于小鼠腸道菌群的調節作用，選用SPF 級12 周齡的成年Balb/c 小鼠作為研究對象，所有小鼠均身體健康，正常攝食，皮毛光滑，適應4周后，將Balb/c 小鼠連續灌胃0.4 mL XL10 菌懸液（108CFU/mL）14 d，并且在第0天、第7天、第14天和第21天采用腹部按摩法收集小鼠0.5 g～0.8 g 糞便，進行菌群結構的分析。

2.8 馬乳酒樣乳桿菌XL10對于小鼠腸道菌群的影響

選擇皮毛光澤、行為正常、食欲良好、糞便成型度明顯改善的實驗小鼠，利用基因組提取試劑盒分別提取各時間點樣品基因組DNA，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組條帶較亮并無拖尾現象的DNA 樣品交由蘇州金唯智生物科技有限公司，進行宏基因組16s 測序。

3 結果與討論

3.1 菌株的分離、純化與鑒定

3.1.1 菌株的分離與純化

經2.1 方法分離純化，初步篩選選到12 株菌株，通過觀察菌落形態、革蘭氏染色顯微鏡個體形態（圖略）以及接觸酶試驗，結果如表1和圖1所示。

表1 菌株的分離情況Table 1 Isolation of strains

根據馬乳酒樣乳桿菌的個體形態及菌落形態特征，挑選出一株疑似馬乳酒樣乳桿菌菌株，進行后續的試驗，定名為XL10。

圖1 XL10的顯微鏡照片及在MRS平板上菌落形態Fig.1 The microscope pictures of XL10（A）and the colony morphology on MRS plate（B）

3.1.2 菌株的鑒定

通過對初篩的菌株進一步復篩，得到XL10 菌株菌落形態如圖1A 所示，菌落較小，圓形，微突起，顏色白色，半透明，表面濕潤光滑。菌體個體形態如圖1B所示，菌體特征為長桿狀，菌體相互纏繞成菌團，也有單個分散排列，菌體大小一般為 0.5 μm×10 μm，不產芽孢，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陰性、不運動的桿菌。從掃描電鏡結果（見圖2A）可以看出XL10 菌株表面分泌了多糖，用箭頭標出。

圖2 馬乳酒樣乳桿菌XL10掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of Lactobacillus kefiranofaciens XL10.（A）and（B）at 5000×

XL10 菌株16srDNA 進行測序，核苷酸序列為1 449 bp，NCBI 中（GenBank 的檢索號為 KM086721.1）Blast 分析結果顯示：菌株XL10 同源性最高的是Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985（GenBank accession number：LC071845.1），同源性為 100%。Goodfellow 和O′Donnell[9]認為 DNA 的 G+C mol%差異≤10%～12%及16S rRNA 的序列同源性≥95 %的種可歸為一個屬，并且 Embley 和 Stackebrangdt 認為當 16S rRNA 的序列同源性≥97%時可以認為是一個種。由此可以推斷：菌株XL10，與Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985屬于同一個種。因此，菌株XL10 鑒定為馬乳酒樣乳桿菌。

3.2 XL10的特性研究

3.2.1 XL10 的生長特性

為了研究XL10 生長特性，按照方法2.4 進行生長曲線的測定，測定了在120 h 內XL10 的生長情況，以OD600值為指標，結果如圖3所示。

圖3 馬乳酒樣乳桿菌XL10生長曲線Fig.3 Growth curve for Lactobacillus kefiranofaciens XL10

由圖3可以得知，XL10 在厭氧條件下，30 ℃培養72 h 時生長最為良好。在0～24 h 內OD600值增長緩慢，處于延滯期；24 h～72 h 內OD600值增長速度增快，菌體生長處于對數期；在72 h 之后，OD600值增長緩慢，曲線也趨于平緩，說明此時菌體繁殖幾乎停滯，達到了平穩期。

3.2.2 菌株表面疏水性和自凝集性試驗結果

菌株表面疏水性和自凝集性試驗結果見表2。

表2 菌株表面疏水性和自凝集性試驗結果Table 2 Cell surface hydrophobicity and aggregation of strains

如表2所示，相比另一株馬乳酒樣乳桿菌ZW3 和保加利亞乳桿菌CGMCC1.2161，XL10 表現出了更好的細胞表面疏水性（79.9%）和自凝集能力（27.8%），說明其可能具有較好的粘附性。而研究表明表面疏水性和自凝集性與菌株是否能成功留存在腸道中具有相關性[10]。

3.3 XL10對于小鼠腸道菌群的影響

3.3.1 灌胃后腸道中菌群門水平的結構變化

小鼠腸道中菌群門水平的結構變化如圖4所示。

圖4 小鼠腸道中菌群門水平的結構變化Fig.4 Structural changes in the bacterial phyla of mice

圖4A顯示樣本中細菌界常見的6個菌門豐度分布，其中豐度最高的是擬桿菌門（Bacteroidetes），占53 %，其次為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、Candidate_division_TM7 各占 41%、1.59%、1.32%、1.3%，其他菌門總體豐度在1%以下。

圖4B所示，樣本中細菌門水平上豐度前20個的分布情況，4個不同時間點的腸道菌群結構都有明顯的差異，其中擬桿菌門與厚壁菌門為主要的優勢菌群，在連續灌胃第7天時厚壁菌門/擬桿菌的比例明顯增多，第14天、第21天與第0天相比，厚壁菌門/擬桿菌的比例也偏高。有些研究表明厚壁菌門/擬桿菌的比例與肥胖有關[11-12]，在肥胖人群腸道中厚壁菌門/擬桿菌的比例明顯比正常體重人群偏高。但也有些研究顯示并沒有發現相同的關聯性[13]。本實驗中所用小鼠也未出現體重增加現象。其中隨著灌胃時間的延長，放線菌門豐度明顯增多，由第0天的0.97%到第21天達到3.29%。

3.3.2 灌胃后腸道中菌群科水平的結構變化

為了確定小鼠腸道菌群結構的變化，比較了不同時間段中優勢菌科的相對豐度，如圖5所示。

圖5 所占比例最多的前20個菌科Fig.5 The top 20 bacterial family with the largest proportion

如圖5所示，S24-7、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）是主要的優勢菌群，其中瘤胃菌科及毛螺菌科是腸道中最為豐富的兩類厚壁菌科，可以分解宿主本身不能消化的纖維素和半纖維素，為短鏈脂肪酸的轉化提供底物[14]。毛螺菌科中的很多菌可以產生有益腸道的丁酸，瘤胃菌科的一些菌可以降低克羅恩氏病的發生。在灌胃7 d 時兩者所占的比例明顯增多，但在14 d 時都有明顯降低，而氣球菌科（Aerococcaceae）明顯增多。據研究表明，理研氏菌（Rikenellaceae）在腸道中的數量增多往往是由于肥胖及腸道炎癥的發生發展[15-16]，與生物鐘紊亂也有關聯[12]。與0 d 相比，實驗中7 d 和21 d 時小鼠糞便中的理研氏菌有所降低，降低了罹患腸道炎癥的風險。雙歧桿菌科被認為是具有益生功能的一類菌[17]，在0 d 時小鼠腸道中并沒有檢出，但灌胃時間增加，其豐度開始增加，在14 d 達到相對豐度最高（0.59%）。

3.3.3 灌胃后腸道中菌群屬水平的結構變化

為了確定小鼠腸道菌群結構的變化，我們比較了不同時間段中菌屬的種類變化，如圖6所示。

由圖6顯示，4個不同時間點的樣本共同所具有的菌屬共有105類，主要集中為擬桿菌門（16類）、厚壁菌門（51類）和變形菌門（17類）等小鼠腸道中的核心菌群，其中在第0天腸道中獨有的菌屬最為豐富，主要集中為放線菌門（13類）和變形菌門（42類），而變形菌門通常被認為包括多種病原菌，如大腸桿菌，沙門氏菌，弧菌等。在0 d 腸道中發現含有變形菌門中的巴斯德科（Pasteurella），其包括多種病原菌，例如鼠疫桿菌，可寄生于脊椎動物，引發體內出血[18]。在第7天的糞便樣品中發現了丁酸弧菌屬，它可以產生短鏈脂肪酸，抑制腸炎發生，屬于腸道有益菌[19-20]。在14 d 也發現了產生丁酸鹽的假丁酸弧菌屬（Pseudobutyrivibrio）。在停止灌胃7 d 后腸道中特有的菌屬主要集中在變形菌門，約占總數的37%。由此可以看出，經過連續灌胃14 d 后，小鼠腸道中的菌群結構發生變化，主要體現為變形菌門的種類下降，代謝產生丁酸鹽的菌屬出現，在停止灌胃后，變形菌門的種類又有增多。

圖6 灌胃XL10后小鼠腸道菌群在屬水平上變化的維恩圖Fig.6 Venn diagram showing the shift in the structural modulation of the gut microbiota at the genus level after XL10 oral intubation

4 結論

本文從開菲爾粒中分離得到一株乳酸菌，經過生理生化和16srDNA 鑒定該菌株為馬乳酒樣乳桿菌，命名為XL10；小鼠灌胃XL10 后菌群結構變化結果顯示：變形菌門的種類下降，代謝產生丁酸鹽的菌屬（丁酸弧菌屬和假丁酸弧菌屬）出現，隨著灌胃時間的延長雙歧桿菌增多，在14 d 達到相對豐度最高（0.59%），而致病性理研菌科有所降低，說明馬乳酒樣乳桿菌XL10 菌株可以一定程度上促進腸道有益菌的生長，抑制有害菌繁殖，調節腸道菌群平衡的潛力，本研究結果為今后馬乳酒樣乳桿菌XL10 的進一步深入研究其作用機理和功能奠定了基礎。