柱前衍生法測定功能性飲料與口服液中的牛磺酸

徐彬，李飛，趙海萍，程立媛，*

（1.海南省食品檢驗(yàn)檢測中心，海南 海口 570314；2.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056038）

牛磺酸（taurine），因存在于牛黃中，后經(jīng)分離，故得名牛磺酸。牛磺酸以游離的狀態(tài)存在于人體，雖然不參與人體蛋白的合成，但卻與體內(nèi)胱氨酸、半胱氨酸的代謝有關(guān)系。針對(duì)牛磺酸的生理功能和藥物作用，有學(xué)者做了相關(guān)的詳細(xì)研究。其中舒志成等[1]提出，牛磺酸可以提高機(jī)體的免疫力，同時(shí)給予人體能量，這個(gè)作用和咖啡因的外源性刺激有明顯的不同。楊祖英等[2]提出牛磺酸直接參與細(xì)胞膜的穩(wěn)定，有一定的抗氧化和外源性化合物解毒作用，且具有多種生物活性，在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景。但牛磺酸合成酶在人體活性較低，所以人體牛磺酸主要來源于外界的攝取。高亞等[3]對(duì)牛磺酸的降血糖作用進(jìn)行了系統(tǒng)的梳理，為其在功能食品領(lǐng)域提供了參考依據(jù)。

牛磺酸在海產(chǎn)品中含量較高，其中徐莉等[4]研究了海口地區(qū)牡蠣中牛磺酸的含量，有的達(dá)到了9.52 mg/g。高加龍等[5]對(duì)南海不同產(chǎn)地的近江牡蠣也進(jìn)行了牛磺酸衍生研究，徐成等[6]采用超高壓法提取牡蠣中的牛磺酸，最高提取量達(dá)到了22.96 mg/g，更加印證了牡蠣中高含量牛磺酸的存在。王芬等[7]對(duì)紫菜中的牛磺酸進(jìn)行了鄰苯二甲醛衍生處理，也得到了較好的結(jié)果。人乳和牛乳在不同時(shí)期含有的牛磺酸含量也不同[8]，其中前者約是后者的8.2 倍，尤其在初乳期（產(chǎn)后0～14 d），最大含量可達(dá)17.8 mg/100 g，因此應(yīng)大力提倡母乳喂養(yǎng)。不同國家對(duì)牛磺酸的年均消費(fèi)量差別比較大，中國的年消費(fèi)量僅為2 g/年，大大低于平均消費(fèi)水平，提高牛磺酸的攝入量，勢在必行。

牛磺酸作為添加劑，允許其添加在奶粉，含乳飲料，功能性飲料，保健食品中，并被強(qiáng)制性添加入嬰幼兒配方奶粉，目前含有牛磺酸的功能性飲料和口服液品種較多，針對(duì)其中的牛磺酸檢測方法也是各有優(yōu)劣，而其中主要檢測的方法包括熒光光譜法[9]，自動(dòng)氨基酸分析法[10]，薄層色譜法[11]，離子交換紫外分光光度法[12]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13-14]。其中薄層色譜法是一種半定量方法，但此種方法的薄層板厚度，薄層板制備技術(shù)，點(diǎn)樣技術(shù)和展開條件難以保持不變，這影響了定量分析的準(zhǔn)確性，因此應(yīng)用較少。熒光法對(duì)樣品的衍生化要求較高，往往需要添加還原劑，試驗(yàn)條件較難控制。自動(dòng)氨基酸分析方法是一種在線添加衍生化試劑的分析方法，其分析類型和數(shù)量有限。而高效液相色譜法靈敏度高，效率高，分離性能優(yōu)異，幾乎不會(huì)對(duì)物質(zhì)造成損害，可靠性好，分析時(shí)間短，流動(dòng)相條件溫和，因此應(yīng)用較廣。

針對(duì)市面上標(biāo)識(shí)有牛磺酸的功能性飲料和口服液，有較多的學(xué)者進(jìn)行了高效液相色譜衍生分析，得到了較好的結(jié)果，其中選用的衍生試劑有9-氯甲酸芴甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC）[15]，鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）[16-18]，異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）[19-20]，2，4 二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）[21-23]，2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNClB）[24]，丹磺酰氯[25]，具體試驗(yàn)條件以及相應(yīng)結(jié)果列于表1。

表1 功能性飲料和口服液中牛磺酸的衍生反應(yīng)一覽Table 1 Overview of derivatization reactions of taurine in energy drinks and oral liquids

續(xù)表1 功能性飲料和口服液中牛磺酸的衍生反應(yīng)一覽Continue table 1 Overview of derivatization reactions of taurine in energy drinks and oral liquids

丹磺酰氯也可以用于衍生處理其他基質(zhì)中的牛磺酸，David 等進(jìn)行了牛奶和嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸衍生的研究。作者匯總了20個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)8個(gè)盲樣的分析結(jié)果，認(rèn)為當(dāng)固體樣品牛磺酸含量在5 mg/100 g～100 mg/100 g 范圍，使用此種衍生方法比較合適。但對(duì)于內(nèi)源性牛磺酸含量低于3.5 mg/100 g 的樣品，精密度則較差[26]。Biondi 等采用丹磺酰氯對(duì)血漿中的牛磺酸進(jìn)行了衍生處理，采用高效液相色譜-熒光檢測器檢測衍生產(chǎn)物，試驗(yàn)中對(duì)哺乳動(dòng)物狗，貓，以及貓耳草中含有的牛磺酸進(jìn)行了檢測，通過加入內(nèi)標(biāo)物的方法進(jìn)行定量，也得到了比較好的結(jié)果[27]。丹磺酰氯作為衍生劑有很多的優(yōu)勢，比如：操作比較簡單、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、熒光或紫外吸收強(qiáng)、靈敏度高等。本文在GB5009.169-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中牛磺酸的測定》基礎(chǔ)上[28]，針對(duì)衍生試驗(yàn)中涉及衍生溫度，衍生時(shí)間，衍生劑用量以及衍生溶液pH 值，使用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方式進(jìn)行了條件的優(yōu)化，并對(duì)功能性飲料和口服液中的牛磺酸進(jìn)行了測試分析。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛磺酸：分析純，99.0%，北京百靈威試劑有限公司；丹磺酰氯（色譜純，98%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（HPLC）：韓國德山藥品工業(yè)；乙酸鈉：優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；冰乙酸：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸：分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；無水碳酸鈉：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；有機(jī)濾膜（0.45 μm）：上海市新亞凈化器件廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器）：美國安捷倫科技公司；ABS240 電子分析天平：上海梅特勒公司；系列移液器（10 μL～100 μL；20 μL～200 μL；100 μL～1 000 μL；1 000 μL～5 000 μL）：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18 柱（150 mm×5.0 mm，4.6 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：乙酸鈉（pH=4.2）-乙腈（體積比 70∶30）等度洗脫；流速：0.8 mL/min；紫外檢測器波長：254 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.2 溶液配制

牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取1.010 g 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品，加水定容至100 mL，得到濃度為10 mg/mL 的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

丹磺酰氯衍生劑：準(zhǔn)確稱量0.153 g 丹磺酰氯，乙腈定容至100 mL，得到1.5 mg/L 的丹磺酰氯乙腈溶液，此衍生試劑在4 ℃避光可保存1個(gè)月。

鹽酸衍生終止溶液：準(zhǔn)確量取0.9 mL 濃鹽酸，加水定容至10 mL，此溶液室溫可保存3個(gè)月。

碳酸鈉緩沖液：準(zhǔn)確稱量0.424 g 無水碳酸鈉，先用40 mL 水溶解，使用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值為9.5，最后加水定容至50 mL，此溶液室溫可保存1個(gè)月。

乙酸鈉緩沖溶液：準(zhǔn)確稱量0.82 g 乙酸鈉，先溶于800 mL 超純水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH 值為4.2，最后加水定容至1 000 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 衍生方法

單因素試驗(yàn)主要考察衍生溫度、衍生時(shí)間、衍生劑用量和衍生溶液pH 值4個(gè)因素，篩選單因素試驗(yàn)條件時(shí)，需要同時(shí)固定其它3個(gè)條件，改變待測試的試驗(yàn)條件，每個(gè)單因素試驗(yàn)至少做3 組。

正交試驗(yàn)是在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考察衍生溫度、衍生時(shí)間、衍生劑用量和衍生溶液pH 對(duì)牛磺酸衍生物峰面積的影響。選取四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，試驗(yàn)以牛磺酸衍生物的峰面積作為考察指標(biāo)，確定反應(yīng)最優(yōu)條件組合，具體因素水平表列于表2。

衍生試驗(yàn)基本步驟如下：使用10 mL 具塞管進(jìn)行衍生試驗(yàn)，分別加入1 mL 碳酸鈉緩沖溶液，1 mL 樣品，一定體積的丹磺酰氯，然后立即放入溫度已經(jīng)穩(wěn)定的水浴鍋中，一定時(shí)間后取出，加入100 μL 鹽酸溶液終止試驗(yàn)。溶液過0.45 μm 有機(jī)濾膜，待上機(jī)測試，牛磺酸的含量采用外標(biāo)法定量。

表2 四因素三水平表格Table 2 Orthogonal table of four factors and three levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)均選取15 μg/mL 的牛磺酸工作液作為衍生對(duì)象，以牛磺酸衍生物峰面積作為考察指標(biāo)。

2.1.1 溶液pH 值

固定衍生反應(yīng)溫度35 ℃，衍生時(shí)間35 min，衍生試劑用量300 μL，調(diào)節(jié)衍生溶液的pH 值為8、9.5、11（通過加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)），不同pH 值條件下測得牛磺酸衍生物峰面積分別為：236.0，469.4，312.6，因此確定衍生溶液的pH 值為9.5。

2.1.2 衍生時(shí)間

固定衍生溶液pH 值為9.5，衍生溫度35 ℃，衍生劑用量 300 μL，調(diào)整衍生時(shí)間為 10、20、35 、50 min，不同衍生時(shí)間下得到的牛磺酸衍生物峰面積分別為364.9，453.1，469.4，421.0，從結(jié)果可以得到牛磺酸溶液在35 min 即可衍生完全，確定衍生時(shí)間為35 min。

2.1.3 衍生溫度

固定衍生溶液pH 值為9.5，衍生時(shí)間35 min，衍生劑用量 300 μL，改變衍生反應(yīng)溫度為 25、35、45、55 ℃，得到的牛磺酸衍生物峰面積分別為：373.0、469.4、403.8、342.1，可以看出，隨著溫度的升高，牛磺酸衍生物峰面積先增加后降低，在35 ℃出現(xiàn)了最大值，因此選取衍生溫度為35 ℃。

2.1.4 衍生劑用量

固定衍生溶液pH 值為9.5，衍生時(shí)間為35 min，衍生反應(yīng)溫度為35 ℃，選取衍生劑用量為100、200、300、400 μL，得到的牛磺酸衍生物峰面積分別為：122.8、243.8、469.4、439.5，隨著衍生劑用量的增加，峰面積也呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，綜合考量選取衍生劑用量為 300 μL。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證衍生反應(yīng)組合條件，對(duì)應(yīng)的因素名稱和水平選擇以及相應(yīng)的正交試驗(yàn)結(jié)果列于表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

圖1是針對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行的直觀分析圖。

圖1 丹磺酰氯衍生牛磺酸正交試驗(yàn)直觀分析圖Fig.1 Visual analysis of orthogonal experiment of taurine derived from dansyl chloride

通過圖形，可明顯看出，在溫度為35 ℃，衍生時(shí)間為35 min，衍生劑用量為300 μL，衍生溶液pH 值為9.5 時(shí)，牛磺酸衍生物峰面積達(dá)到最大值。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，可以發(fā)現(xiàn)衍生劑用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，但是當(dāng)衍生劑增大到一定程度時(shí)，對(duì)結(jié)果的影響反而變小。而對(duì)于衍生時(shí)間和衍生溶液的pH值而言，則存在最佳的條件。因此確定后續(xù)試驗(yàn)的衍生試驗(yàn)條件組合為衍生溫度35 ℃，衍生時(shí)間35 min，衍生劑用量300 μL，衍生溶液pH 9.5。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)譜圖

空白衍生試劑以及牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。

從圖2（a）中可以明顯看出空白衍生試劑僅有丹磺酰氯色譜峰，而牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖（圖2（b））則包含丹磺酰氯峰以及牛磺酸衍生峰，且兩峰分離度較好（R＞3）。

圖2 衍生色譜圖Fig.2 Derivatization chromatogram

2.4 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行衍生，衍生物峰面積對(duì)濃度作圖，得到回歸方程為y=11.933x-4.838 7，相關(guān)系數(shù)為 0.999，表明牛磺酸濃度在 5 μg/mL～50 μg/mL時(shí)，峰面積對(duì)其呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線列于圖3。

圖3 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.3 Standard working curve of taurine

2.5 方法重復(fù)性

為了考察所建立方法的重復(fù)性，在最優(yōu)的試驗(yàn)條件下，對(duì)同一濃度的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6 組平行衍生實(shí)驗(yàn)，得到的牛磺酸衍生物峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為 1.4%，保留時(shí)間的RSD 值為0.3%，說明該方法的重復(fù)性較好。

2.6 樣品測定

依據(jù)牛磺酸線性濃度范圍，酌情稀釋所要測定的功能性飲料和口服液樣品，并在最優(yōu)的試驗(yàn)條件下，進(jìn)行樣品衍生試驗(yàn)，衍生試驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4 功能性飲料和口服液樣品中牛磺酸含量一覽表Table 4 List of taurine contents in functional beverages and oral liquid samples

續(xù)表4 功能性飲料和口服液樣品中牛磺酸含量一覽表Continue table 4 List of taurine contents in functional beverages and oral liquid samples

從表中可以看出，樣品測量值與實(shí)際標(biāo)示值的誤差在-10.0%～+10.0%之間，對(duì)其中功能性飲料中的樣品7 和樣品9（加標(biāo)水平均為0.5 mg/mL）進(jìn)行加標(biāo)回收測試，回收率分別為108.0%和94.6%之間。對(duì)口服液的3個(gè)樣品（樣品13、樣品14、樣品15）進(jìn)行加標(biāo)回收測試，加標(biāo)水平分別為0.39、5.0、0.4 mg/mL，加標(biāo)回收率分別為90.7%、103.3%和107.6%。針對(duì)口服液的3個(gè)樣品，每個(gè)樣品均做了平行測試，測試得出的平均偏差分別為2.7%、2.8%、2.5%。

其中樣品7 以及樣品9 的譜圖以及加標(biāo)譜圖列于圖4。實(shí)際樣品在牛磺酸位置處無明顯干擾峰，且和標(biāo)準(zhǔn)的牛磺酸保留時(shí)間基本一致，可判定為同一種。

圖4 樣品以及加標(biāo)樣品特征譜圖Fig.4 Characteristic chromatograms of samples and spiked samples

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方式確定了丹磺酰氯衍生牛磺酸的試驗(yàn)條件，在衍生溫度為35 ℃，衍生時(shí)間35 min，衍生劑用量300 μL，衍生環(huán)境pH 值為9.5 時(shí)，衍生效果較好。牛磺酸的濃度為5 μg/mL～50 μg/mL 時(shí)，線性相關(guān)性較好，6 組重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為1.4%，對(duì)功能性飲料和口服液中牛磺酸含量進(jìn)行了測試分析，測量值與標(biāo)識(shí)值誤差在-10.0%～+10.0%，樣品平行測試偏差較小，綜上此種方法反應(yīng)條件溫和，實(shí)際操作性較強(qiáng)。