Box-Behnken試驗設計優化內部沸騰法提取荸薺皮多糖工藝

汪建紅

（1.內江師范學院化學化工學院，四川 內江 641110；2.四川省高等學校果類廢棄物資源化重點實驗室，四川 內江 641110）

荸薺是一種較為常見的香甜可口、美味多汁、營養豐富的水果，我國的種植面積達到5 萬hm2以上，年產鮮果百萬t 以上，按照總荸薺質量的26%計算荸薺果皮質量，每年可產生26 萬t 以上的荸薺皮[1-7]。這些荸薺皮往往得不到充分利用，造成巨大的浪費。荸薺皮營養豐富，富含多種功能成分，比如多糖、黃酮等[8-9]。多糖具有消炎、抗腫瘤等多種生物活性，提取荸薺皮中的多糖可使資源得到更充分的利用，實現經濟價值最大化，也符合綠色環保的時代觀念[10]。

提取多糖的常見方法有熱水浸提法、超聲波法、微波法、酶法等。熱水浸提法[11]的提取效率較低，且提取物雜質含量較多。超聲波法[12-15]和微波法[16-17]效率高，時間短，但都會對人體帶來負面影響，危害人體健康。酶法[18-19]提取效率較高，但操作步驟多，還需要后處理，且酶易失活，部分酶還會導致多糖分解。內部沸騰法[20-21]是一種較新的提取方法，利用在細胞組織內部的沸騰使多糖更容易解吸進入溶液中，可快速高效的提取多糖，并且提取時間較短。因此本文采用內部沸騰法提取荸薺皮中多糖，并利用Box-Behnken 試驗設計模型優化提取工藝條件，以獲得較為準確的結果，為荸薺皮多糖的開發利用提供基本參考依據。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

荸薺：四川內江東興區農貿市場；葡萄糖、乙酸鈉、乙酸、無水乙醇（分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T-6 型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州英峪予華儀器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；FA2204A 型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；SHA-B 恒溫水浴振蕩器：金壇市漢康電子有限公司；DFT-100 型手提式萬能高速粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；SHB-B95 型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；CS101-2AB 型電熱鼓風干燥箱：重慶試驗設備廠。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

將荸薺取皮后洗凈，在鼓風干燥箱中低溫烘干后，粉碎備用。

2.2 標準曲線的繪制

按照文獻方法[18-19，22]，以烘干至恒重的葡萄糖為原料設計方案繪制標準曲線，并得出在0.008 mg/mL～0.048 mg/mL 的濃度范圍內的線性回歸方程為A =33.4C-0.070 4，R2=0.999 4。

2.3 荸薺皮多糖的提取和測定

在圓底燒瓶中加入1.00 g 荸薺皮粉和5 mL80%的乙醇溶液，常溫下浸泡 30 min，然后按照 20∶1（mL/g）的液料比加入一定pH 值和溫度的水作溶劑，并保持在此溫度下水浴回流一定時間，冷卻，離心獲取上層清液，將該清液轉移到50 mL 容量瓶中，用水定容。

從此容量瓶中準確移取1.00 mL 提取液，稀釋250倍，再準確移取1.00 mL 稀釋液，利用6%的苯酚溶液和濃硫酸顯色，顯色后在490 nm 波長處測定其吸光度，并利用標準曲線計算得到的稀釋液中多糖濃度，按照式（1）計算多糖得率。

2.4 單因素試驗

在荸薺皮粉質量為1.00 g，乙醇濃度80%，乙醇體積 5 mL，液料比 20∶1（mL/g）的條件下，考查 pH 值（3、4、5、6、7）、提取溫度（75、80、85、90、95 ℃）和提取時間（10、20、30、40、50 min）等單因素對多糖得率的影響。

2.5 響應面試驗

根據單因素試驗的結果，以pH 值A、提取溫度B和提取時間C 為自變量，以多糖得率R 為響應值，采用Box-Behnken 設計法設計響應面模型，其中5個中心點試驗，12個試因試驗，并按照模型安排響應面試驗，優化試驗條件。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 pH 值對荸薺皮多糖得率的影響

pH 值對荸薺皮多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 pH值的影響Fig.1 Influence of pH

從圖1可看到，在3～7 范圍內，隨著pH 值的增大，多糖得率先增加后下降，在pH=5 時出現拐點。這是因為一定pH 值時，荸薺皮組織會變得較為脆弱，內部沸騰對荸薺皮的作用效果更好，有利于多糖解吸進入溶液中[23-24]。因此選擇最佳pH 值為5。

3.1.2 提取溫度對荸薺皮多糖得率的影響

提取溫度對荸薺皮多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 溫度的影響Fig.2 Influecne of temperature

從圖2可看到，隨溫度的增加，多糖得率先逐漸增加，然后逐漸降低，當溫度為80 ℃時，得率達到峰值。這是因為，溫度越高，分子運動越活躍，內部沸騰越劇烈，越有利于多糖解吸后擴散到溶液中；但溫度過高時，對流擴散維持時間會縮短，由于多糖分子較大，擴散遷移較慢，會導致大量多糖在擴散出之前就已經造成了溶出通道的堵塞[23-24]。因此，選擇最佳提取溫度為80 ℃。

3.1.3 提取時間對荸薺皮多糖得率的影響

提取時間對荸薺皮多糖提取效果的影響如圖3所示。

圖3 時間的影響Fig.3 Influence of time

從圖3可知，隨時間的延長，多糖得率呈先逐漸增大后逐漸降低的趨勢，且拐點出現在30 min 時。這是由于時間越長，就會有越多的多糖在內部沸騰作用下擴散到提取溶液中；但時間過長時，內部沸騰已接近于停止，擴散通道已近乎于堵塞，導致更多的多糖難以浸出，已經浸出的多糖也可能部分分解變質[23-24]。因此選擇最佳提取時間為30 min。

3.2 響應面試驗設計、分析及結果

3.2.1 響應面試驗設計

根據單因素試驗的結果，以pH 值A、提取溫度B和提取時間C 為自變量，以多糖得率R 為響應值，采用Box-Behnken 設計法設計的響應面模型因素水平編碼如表1所示，試驗方案及結果如表2所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

表2 關于多糖得率的響應面試驗方案及其結果Table 2 Response surface design arrangement on yield of polysaccharide and the results

3.2.2 方差分析

利用Design Expert 8.05b 軟件對數據進行分析，得出荸薺皮多糖得率對pH 值、提取溫度和提取時間的二次多項回歸方程為：

R=19.3-0.017A+0.42B-0.81C-0.065AB+0.57AC+1.04BC-1.88A2-0.76B2-0.56C2

方差分析見表3，可信度分析見表4。

從表3可看到該模型的P＜0.001，極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，說明該模型的方差均由隨機誤差引起。從表4可知該模型的R2=0.991 1，R2Adj=0.979 6，說明該模型擬合情況良好，回歸效果也較好，可以解釋99.11%響應值變化，未控制因素對試驗結果影響較小（0.89 %）；且 CV=1.15 %，信噪比為 24.914，說明試驗誤差小，說明用此模型對多糖得率進行預測是可行的。

從表3還可看到一次項中B（溫度）、C（時間）對多糖得率的影響極顯著（P＜0.001），A（pH 值）的影響不顯著；二次項中 AC、BC、A2、B2和 C2的影響極顯著，AB的影響不顯著。根據表中F 值的大小可知各因素影響先后次序為：C＞B＞A。

3.2.3 響應面圖和等高線分析

各因素間交互作用的響應面圖和等高線如圖4～圖6所示。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

表4 回歸方程可信度分析Table 4 Creditability analysis of regression equations

圖4 溫度、pH 值對多糖得率的影響Fig.4 Influence of temperature and pH on yield of polysaccharide

圖5 時間、溫度對多糖得率的影響Fig.5 Influence of time and temperature on yield of polysaccharide

從圖4～圖6還可看到pH 值、溫度和時間之間存在交互效應，對多糖得率影響不是簡單線性關系，從曲線上表現出來：時間影響使曲線更陡峭，溫度次之，pH 值最平緩，該結論與方差分析表中的結果一致。

3.2.4 最佳試驗條件的獲得和驗證試驗

通過Design Expert 8.05b 軟件對響應面結果的優化分析，得出荸薺皮多糖提取的提取工藝優化條件為：pH4.85，溫度 78 ℃，時間 20 min，在該條件下多糖得率理論上可達19.72%，但考慮到操作的方便，將最佳工藝條件修正為pH 5，溫度80 ℃，時間20 min，此時理論預測值為19.55%。在此條件下作5 次平行試驗，得到荸薺皮多糖的平均得率為20.07%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 3.45 %，與理論預測值的相對誤差為2.66%。此結果與預測值接近，說明了此模型的可靠性。

圖6 pH值、時間對多糖得率的影響Fig.6 Influence of pH and time on yield of polysaccharide

4 結論

將常作為垃圾被拋棄的荸薺皮作為提取多糖的原料，既提高了荸薺的利用價值，還可減少荸薺皮對環境的污染。本試驗建立了利用內部沸騰法提取荸薺皮中多糖的工藝方法，并利用響應面模型對內部沸騰法提取荸薺皮多糖的工藝條件進行優化，得出其最佳條件為：pH 4.85，溫度 78 ℃，時間 20 min，考慮到操作方便性，將條件修正為：pH 5，溫度 80 ℃，時間 20 min，此條件下驗證試驗的平均得率為20.07%（RSD=3.45%），與該條件下理論預測值19.55%的相對誤差為2.66%。該方法獲得的多糖得率比相同條件下熱水浸提法時的多糖得率17.57%高14.23%，說明了內部沸騰法的優點，是一種值得研究的方法。該結論為荸薺皮多糖的開發利用提供了一定的參考依據。