藍(lán)莓果渣花青素的超聲提取及組成分析

葉紅玲，姚軍，劉冬，徐基艷，陳雪

（1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系，安徽 安慶 246003；2.安慶市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 安慶 246000；3.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

花青素廣泛存在于多種水果和蔬菜中，不僅賦予果蔬以鮮艷的顏色，對(duì)人類健康也具有重要作用。鄒小波等[1]從玫瑰、藍(lán)莓等原料中提取天然花青素，與殼聚糖混合制成抗氧化復(fù)合膜用于食品保藏；秦朝等[2]的研究表明花青素能有效抑制腫瘤組織中高表達(dá)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-π，可用于治療非小細(xì)胞肺癌。姚佳宇等[3]指出藍(lán)莓花青素能有效預(yù)防和治療屈光不正、青光眼、視網(wǎng)膜損傷等多種眼部病癥。

藍(lán)莓因花青素含量極高，食用、藥用價(jià)值得到廣泛關(guān)注，近十年來產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[4-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全國(guó)藍(lán)莓種植面積達(dá)46 891 公頃，總產(chǎn)量約114 905 噸。預(yù)計(jì)到2026年中國(guó)藍(lán)莓年產(chǎn)量可達(dá)100 萬噸，將成為全球第一大藍(lán)莓生產(chǎn)國(guó)。藍(lán)莓果實(shí)除了供應(yīng)鮮食之外，加工率約占總產(chǎn)量的45%，主要應(yīng)用于藍(lán)莓相關(guān)食品、藥品、保健品和化妝品領(lǐng)域[7-10]。藍(lán)莓加工中產(chǎn)生的大量果渣利用率極低，造成了藍(lán)莓資源的浪費(fèi)。本研究以超聲波輔助乙醇溶液提取藍(lán)莓果渣中花青素，通過對(duì)提取工藝的優(yōu)化，以期為藍(lán)莓資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果渣：安慶市錦華藍(lán)莓有限公司。藍(lán)莓榨汁后剩余果渣于40 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)恒溫干燥，至含水量10%進(jìn)行粉碎，過80 目篩，收集篩下的果渣粉作為花青素提取原料。

花青素標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma 公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000 液相色譜儀：美國(guó)戴安公司；ZOLLO-650CT超聲波提取機(jī)：上海左樂儀器有限公司；UY120 型電子精密天平：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素提取率的測(cè)定方法

依據(jù)LEE 等[11]的方法，以矢車菊3-O-葡萄糖苷為參照，采用雙波長(zhǎng)pH 示差法測(cè)定提取液中花青素含量，并按下式計(jì)算提取率。

花青素提取率/（mg/g）=（A×M×K×100）/（ε×L）

式中：A =（A510nm，pH1.0- A700nm，pH1.0）-（A510nm，pH4.5-A700nm，pH4.5）；M 為矢車菊 3-O-葡萄糖苷相對(duì)分子質(zhì)量，449.21 g/mol；K 為溶液稀釋倍數(shù)；ε 為矢車菊 3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L 為比色皿光程，1 cm。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

稱取1 g 藍(lán)莓果渣粉，移入一定體積酸性乙醇提取液。分別考察提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%）、乙醇溶液 pH 值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）、提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）]、超聲功率（100、200、300、400 W）、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）對(duì)提取率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇乙醇溶液pH 值、提取時(shí)間、料液比、超聲功率4個(gè)因素，實(shí)施L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化花青素提取工藝參數(shù)，因素和水平安排見表1。

1.3.4 藍(lán)莓果渣花青素的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

按NY/T2640-2014《植物源性食品中花青素的測(cè)定》中規(guī)定的方法進(jìn)行樣品前處理，并用高效液相色譜分析果渣中花青素組成成分[12]。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The design of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響見圖1。

圖1 提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on anthocyanin yield

由圖1可以看出，當(dāng)提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)由50%逐漸增加到80%時(shí)，70%的乙醇溶液對(duì)花青素的提取效果最佳。增加或減少提取液中乙醇濃度，提取率都表現(xiàn)不同程度的降低。這是因?yàn)橐掖既芤簶O性隨濃度的變化而變化，適宜的極性條件能促進(jìn)花青素的溶出，當(dāng)溶液極性超出一定限值時(shí)，反而不利于花青素的提取[13]。因此確定提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.1.2 乙醇溶液pH 值的確定

孫倩怡等[14]曾在研究中指出藍(lán)莓花青素在酸性條件下更穩(wěn)定，潘利華等[9]的研究結(jié)果也表明，當(dāng)乙醇提取溶液的pH 值由4.0 增加至7.0 時(shí)，隨pH 值的增加，藍(lán)莓花青素的提取率逐漸降低。固定其他工藝參數(shù)不變，不同pH 值的乙醇溶液對(duì)花青素提取率的影響如圖2所示。

pH 3.0 的乙醇溶液提取效果最優(yōu)，每克果渣中花青素提取量可達(dá)7.23 mg。當(dāng)乙醇溶液pH 值繼續(xù)增加至4.0 時(shí)，花青素的提取率降至5.88 mg/g，降幅約為19%。因此確定乙醇溶液的pH 值為3.0。

2.1.3 提取時(shí)間的確定

超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖3。

圖2 乙醇溶液pH值對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of solvent pH on anthocyanin yield

圖3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on anthocyanin yield

如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間由10 min 增加至20 min時(shí)，花青素提取率呈明顯上升趨勢(shì)，增幅約為15%，并在20 min 時(shí)達(dá)到峰值，此后再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，花青素提取率不再顯著增加。這可能是因?yàn)槌曒o助提取20 min，果渣中花青素提取已經(jīng)較完全或提取液的提取能力達(dá)到飽和。因此確定超聲時(shí)間為20 min。

2.1.4 料液比的確定

料液比對(duì)提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on anthocyanin yield

由圖4可以看出，當(dāng)料液比在 1∶15（g/mL）～1∶30（g/mL）范圍內(nèi)，花青素提取率和料液比呈正相關(guān)，當(dāng)料液比至 1∶30（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到 9.48 mg/g，此后繼續(xù)加大提取液用量，花青素提取率變化較小。這說明當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）時(shí)，果渣中花青素已經(jīng)充分提取，再持續(xù)增大料液比，為后續(xù)濃縮處理增加負(fù)擔(dān)，也會(huì)造成成本增加。因此料液比確定為 1∶30（g/mL）。

2.1.5 超聲功率的確定

超聲功率對(duì)提取率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on anthocyanin yield

從圖5中可見，當(dāng)超聲功率增至200 W（超聲提取2 s，間歇4 s）時(shí)，每克果渣中花青素提取率可達(dá)9.53 mg。超聲功率高于或低于200 W（超聲提取2 s，間歇4 s），花青素提取效果都呈現(xiàn)不同程度的降低。這是因?yàn)橐欢üβ实某暡梢源龠M(jìn)花青素的溶出，但超過一定強(qiáng)度，可能會(huì)破壞其化學(xué)鍵，而導(dǎo)致花青素的分解，對(duì)提取不利[15]。因此超聲功率確定為200 W（超聲提取2 s，間歇4 s）。

2.1.6 超聲溫度的確定

超聲溫度對(duì)提取率的影響見圖6。

圖6 超聲溫度對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on anthocyanin yield

從圖6中可看出，當(dāng)超聲提取溫度由30 ℃增加到70 ℃時(shí)，提取率隨溫度的升高而降低。這是因?yàn)樗{(lán)莓花青素對(duì)熱不穩(wěn)定，提取溫度過高或超聲過程產(chǎn)生的熱量過高都可能導(dǎo)致花青素的熱分解[14，16-17]。據(jù)此，確定超聲提取溫度為30 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響藍(lán)莓果渣花青素提取效果的4個(gè)主要因素，即乙醇溶液pH 值（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）和超聲功率（D），進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果見表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The analysis results of orthogonal experiment

續(xù)表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 The analysis results of orthogonal experiment

4個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓果渣花青素提取效果的顯著性依次是：超聲功率＞提取時(shí)間＞乙醇溶液pH 值＞料液比。依據(jù)均值的結(jié)果，最優(yōu)提取工藝應(yīng)為A1B3C2D2。但9 組正交試驗(yàn)中，第二組試驗(yàn)（A1B2C2D2）提取率最高，每克果渣可提取9.99 毫克花青素。對(duì)A1B3C2D2組合的試驗(yàn)方案進(jìn)行花青素提取驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定提取率為10.02 mg/g，兩組試驗(yàn)提取率相差甚微，從生產(chǎn)時(shí)間和儀器使用成本考慮，推薦超聲波輔助乙醇溶液提取藍(lán)莓果渣中花青素最佳提取條件為：A1B2C2D2，即乙醇溶液pH 值為2.5、超聲提取時(shí)間 20 min、料液比 1∶30（g/mL）、超聲提取功率200 W（超聲提取2 s，間歇4 s）。

2.3 花青素組成成分分析結(jié)果

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓果中花青素約有16 種，且不同品種藍(lán)莓果中花青素的組成和含量存在差異[18-20]。本試驗(yàn)所用的藍(lán)莓果渣為兔眼系列和南高系列藍(lán)莓鮮果1∶1（質(zhì)量比）混合榨汁后剩余果渣。按1.3.4 中方法進(jìn)行樣品前處理和色譜分析，HPLC 分析結(jié)果如圖7所示。

圖7 藍(lán)莓花青素提取物HPLC圖譜Fig.7 HPLC chromatogram of anthocyanin extract from blueberry

花青素提取液中共有飛燕草等5 種色素，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)從大到小的順序?yàn)椋哄\葵色素（36.26%）、飛燕草色素（24.08 %）、矢車菊色素（22.08 %）、矮牽牛色素（12.53%）和芍藥色素（5.05%），詳見表3所示。

表3 藍(lán)莓果渣花青素成分分析Table 3 Analysis of anthocyanin composition in blueberry pomace

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選用超聲波輔助乙醇溶液提取藍(lán)莓果渣中花青素，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后確定最佳工藝為：以pH 2.5 體積分?jǐn)?shù)70 %的乙醇溶液為提取液、超聲功率200 W（超聲提取 2 s，間歇 4 s）、料液比 1∶30（g/mL）、30 ℃超聲提取20 min，藍(lán)莓果渣中花青素提取率為9.99 mg/g。

果渣中花青素提取物的HPLC 分析結(jié)果表明，果渣中含有飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥色素和錦葵色素5 種藍(lán)莓花青素，分別占花青素總量的24.08%、22.08%、12.53%、5.05%、36.26%。