不同分子量壇紫菜多糖體內(nèi)抗氧化活性研究

應苗苗，施文正，權偉

（1.溫州科技職業(yè)學院，浙江 溫州 325006；2.上海海洋大學，上海 201306）

多糖是一種普遍存在于許多植物組織、動物骨骼[1]及真菌體內(nèi)[2]的大分子活性物質(zhì)，具有降血糖[3]、抗腫瘤[4]、抗輻射[5-6]、抗氧化[7-8]、增強免疫力[9]等生理活性，因此多糖作為天然抗氧化劑具很高的醫(yī)藥開發(fā)價值。當前，海藻功能性類多糖已經(jīng)成為一個新的研究領域。

壇紫菜是我國及東南亞地區(qū)常見的主要紫菜栽培品種之一，研究表明不同分子量的紫菜多糖具有不同的體外抗氧化活性[10-11]，但有關不同分子量壇紫菜多糖體內(nèi)抗氧化活性的報道則較少。作者在前期研究基礎上，采用超濾法將壇紫菜粗多糖進行分離，通過4 種不同截留分子量的超濾膜得到5 種不同分子量的多糖：PPⅠ、PPⅡ、PPⅢ、PPⅣ和 PPⅤ，通過對 5 種不同分子量的多糖進行了體外抗氧化活性分析，實驗結果表明壇紫菜多糖PPⅡ和PPⅣ對自由基清除能力較強，因此本論文通過建立衰老動物模型，主要研究壇紫菜多糖PPⅡ和PP Ⅳ不同劑量下對實驗小鼠肝臟組織、腦組織和血液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影響，探討壇紫菜多糖的體內(nèi)抗氧化活性，以期為壇紫菜多糖的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

壇紫菜樣品：產(chǎn)自浙江省溫州市洞頭縣東海海域。

SOD 試劑盒（WST-1 法）、GSH-PX 測試盒（100T/486 樣）、CAT 試劑盒（100T/96 樣）、MDA（100T/96 樣）試劑盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、無水乙醇、D-半乳糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

R206 旋轉蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；UV/V-16/18-型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；Sartorius天平：北京賽多利斯天平有限公司；HWS-24 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海慧泰儀器制造有限公司；H2050R-臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；ALPHA 2-4 真空冷凍干燥機：德國Christ 公司；W100 循環(huán)水式多用真空泵：上海申勝生物技術有限公司；JYS-M01 粉碎機：九陽股份有限公司；Vivafiow200 超濾系統(tǒng)：德國賽多利斯生物技術有限公司；冰箱：青島海爾電冰箱有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同分子量段壇紫菜多糖的提取與制備

稱取一定量的壇紫菜粉末，按液料比50∶1（mL/g）加入蒸餾水，100 ℃水浴保溫2 h，減壓抽濾后濾渣重復上述操作一次，合并兩次多糖提取液，三氯乙酸除蛋白后分別透過分子截留量為100 000、50 000、10 000、5 000 Da 的超濾系統(tǒng)（Sartorius stedim，Vivafiow 200），將多糖提取物按分子量大小分為MW≥100 000 Da（PPⅠ）、50 000 Da～100 000 Da（PPⅡ）、10 000 Da～50 000 Da（PPⅢ）、5 000 Da～10 000 Da（PPⅣ）、MW≤5 000 Da（PPⅤ）五部分。各部分在負壓0.01MPa、溫度50 ℃的條件下旋轉蒸發(fā)濃縮至原提取液的1/5，加入4 倍體積無水乙醇，邊加邊攪拌，沉淀多糖，而后置于4 ℃冰箱中過夜，析出的絮狀物沉淀4 000 r/min 離心15 min，收集沉淀物后真空冷凍干燥，得到不同分子量段的多糖樣品。

1.2.2 動物模型建立

昆明小鼠90 只，飼養(yǎng)一周熟悉環(huán)境后將小鼠分為9 組，每組10 只，隨機分為正常對照組，衰老模型組，維生素E 組，壇紫菜多糖PPⅡ低劑量組、中劑量組、高劑量組和PPⅣ低劑量組、中劑量組、高劑量組。除正常對照組外，其余8 組每天按時皮下注射D-半乳糖100 mg/（kg·bw·d）建立模型，建模的同時給予相應劑量的多糖溶液灌胃。給藥劑量分別為維生素E 組200 mg/（kg·bw·d），壇紫菜多糖PPⅡ和PPⅣ的低劑量組、中劑量組、高劑量組均分別為100、150、200 mg/（kg·bw·d）。正常對照組和衰老模型組根據(jù)小鼠體重給予相應體積的生理鹽水。每天給藥1 次，每周稱體重1 次以調(diào)整給藥劑量，連續(xù)給藥60 d。最后一次給藥后，所有的小鼠均禁食不禁水24 h，眼眶取血于抗凝血管中放入-80 ℃冰箱冷凍，斷頸處死后取肝臟組織和腦組織在預冷的生理鹽水（0.9%）中漂洗，洗凈表面的血跡，濾紙吸干水分，稱重后放入50 mL 離心管中。加入體積是組織塊重量9 倍的冷生理鹽水，用眼科小剪刀迅速剪碎組織，冰水浴組織搗碎機制備組織勻漿液，4 ℃下3 500 r/min 離心10 min，取10%勻漿上清液按照試劑盒說明書測定各抗氧化指標。

1.2.3 各項抗氧化指標的測定

1.2.3.1 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的測定

1）試劑盒的配制。試劑1：貯備液每瓶2 mL，移液槍準確移取0.1 mL，加入9.9mL 雙蒸水，稀釋100 倍，現(xiàn)用現(xiàn)配；試劑2：甲粉劑一瓶，乙液每瓶50 mL，甲粉劑加入預先加熱至90 ℃～100 ℃的熱雙蒸水170 mL，充分溶解后加入乙液混合均勻。次為過飽和溶液，取上清進行試驗，2 ℃～8 ℃保存；試劑3：粉劑，每瓶加雙蒸水至200 mL 溶解；試劑4：粉劑，每瓶加雙蒸水至50 mL 溶解，避光冷藏保存；試劑5：粉劑，每支加10 mL 雙蒸水充分溶解，避光冷藏保存；試劑6：GSH標準品粉劑，冷藏保存。

2）最佳取樣濃度的測定：由于酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線關系，并且樣品種類不同，其最佳取樣濃度也不同，GSH-Px 的活力也不同。當酶的百分抑制率在45%～55%之間時，樣品濃度可認為是最佳取樣濃度，所以在測定前要做預實驗以確定最佳取樣濃度。

分別取10%的組織勻漿用生理鹽水稀釋成1.0%、0.5 %、0.4 %、0.3 %、0.25 %、0.2 %、0.1 %、0.05 %一系列不同濃度組織勻漿0.2 mL 按表1進行測定。

表1 酶反應試劑表Table 1 Reagent of enzyme reaction

混勻，3 500 r/min 離心15 min，取上清液1 mL 做顯色反應，見表2。

表2 顯色反應試劑表Table 2 Reagent of color reaction

充分搖勻，室溫靜置15 min 后，在波長412 nm下，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值。

抑制率/%=（對照管OD-測定管OD）/對照管OD×100

將測得的各管OD 值帶入上述公式計算抑制率，選取抑制率在45%～55%之間的濃度作為最佳濃度進行后續(xù)GSH-Px 含量的測定。經(jīng)計算，肝臟組織和腦組織的最佳取樣濃度為0.5%的勻漿液，全血的最佳取樣濃度為0.67%。

1.2.3.2 過氧化氫酶（CAT）含量的測定

測定原理：過氧化氫酶（CAT）分解過氧化氫的反應由于鉬酸銨的加入而迅速終止，未反應完的過氧化氫與鉬酸銨結合產(chǎn)生一種淡黃色的絡合物，這種絡合物在波長為405 nm 處有最大吸收，測定其吸光度值，可以計算出CAT 的相應活力。

試劑盒的配制：

試劑1：液體 100 mL，4 ℃冷藏。

試劑2：底物液體 10 mL，4 ℃冷藏。

試劑3：顯色粉劑，加入100 mL 雙蒸水充分溶解，4 ℃冷藏保存。

試劑4：液體 10 mL，4 ℃冷藏。

組織樣本（肝臟組織、腦組織）操作步驟見表3。

表3 組織樣本操作表Table 3 Sample operation of animal tissue

混勻后，405 nm 處測定各管吸光度值，0.5 cm 光程，雙蒸水調(diào)零。

全血的檢測：1%溶血液的制備（取50 μL 全血加雙蒸水至5 mL 充分混勻后放置10 min，待測）。操作步驟見表4。

表4 組織樣本操作表Table 4 Sample operation of animal blood

混勻后，波長405 nm 處測定各管吸光度值，0.5 cm光程，雙蒸水調(diào)零。

1.2.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）含量的測定

試劑1：緩沖液，15 mL，2 ℃～8 ℃保存。

試劑2：底物貯備液，0.15 mL，2 ℃～8 ℃保存。

試劑3：酶貯備液，0.30 mL，2 ℃～8 ℃保存。

試劑4：酶稀釋液，4 mL，2 ℃～8 ℃保存。

操作步驟見表5。

混勻，37 ℃孵育20 min，波長450 nm，酶標儀測定吸光度值。

表5 SOD測定操作表Table 5 Operation of SOD determination

1.2.3.4 丙二醛（MDA）含量的測定

MDA 各試劑配制：試劑1（液體20 mL，室溫保存）；試劑 2（液體 12 mL，加 170 mL 超純水混勻，4 ℃冷藏）；試劑 3（粉劑，加入 90 ℃～100 ℃的熱雙蒸水 30 mL，充分溶解后再加入30 mL 的冰醋酸，混合均勻，避光冷藏）；標準品（10 nmol/mL 四乙氧基丙烷5 mL，4 ℃冷藏）。

操作步驟見表6。

表6 MDA測定操作表Table 6 Operation of MDA determination

各管充分混勻，置于95 ℃水浴鍋中保溫40 min，取出后自來水淋洗冷卻到室溫，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，測定波長532 nm，1 cm 光徑，雙蒸水調(diào)零，然后測定各管吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定結果表示為平均數(shù)±標準差（mean±SD）（n≥3），采用SPSS16.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），以 P＜0.05 作為差異的顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 壇紫菜多糖PPⅡ對衰老模型組小鼠的影響

壇紫菜多糖PPⅡ對衰老模型組小鼠抗氧化活性的影響，如表7所示。給小鼠連續(xù)皮下注射D-半乳糖60 d 后，與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟組織和腦組織中SOD 和GSH-Px 活性及肝臟組織中CAT 活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著升高（P＜0.05），說明模型建立成功。與模型組相比，壇紫菜多糖PPⅡ中劑量組和高劑量組均能顯著提高實驗小鼠肝臟、腦組織和血液中SOD 活性，且高劑量組SOD 活性與VE組活性相當；PPⅡ中劑量組、高劑量組肝臟組織和腦組織中CAT 含量顯著升高，GSH-PX 活性顯著升高，MDA含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。壇紫菜多糖PPⅡ在低劑量時，與模型組相比，大部分的抗氧化指標均不具有統(tǒng)計學意義的差異，無明顯的抗氧化能力。

表7 PPⅡ對衰老模型組小鼠SOD、CAT、GSH-Px和MDA的影響（±s，n=10）Table 7 Effects of PPⅡon SOD，CAT，GSH-Px and MDA in tested organs in aged mice（±s，n=10）

表7 PPⅡ對衰老模型組小鼠SOD、CAT、GSH-Px和MDA的影響（±s，n=10）Table 7 Effects of PPⅡon SOD，CAT，GSH-Px and MDA in tested organs in aged mice（±s，n=10）

注：同一行中不同組別間標以不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

參數(shù) 項目 正常組 模型組 PPⅡ低劑量組 PPⅡ中劑量組 PPⅡ高劑量組 VE 組SOD/（U/mgprot）肝臟47.03±0.11b36.14±0.69a48.00±0.00b48.98±0.96b49.05±0.48c57.64±1.43c腦 48.03±2.08b 37.83±1.80a 47.70±0.40b 49.97±0.40b 60.13±1.42c 65.17±5.29c全血 22.96±1.80a 18.61±0.06a 25.50±0.45a 32.99±5.21b 35.04±0.30b 43.69±6.41b CAT/（U/mgprot）肝臟60.56±4.27c42.75±2.70a53.41±7.26ab80.67±6.54d75.04±1.56d79.77±3.84d腦 32.61±3.98b 28.65±0.74b 17.30±1.77a 21.88±1.77a 45.33±1.03c 30.63±1.47b全血 28.05±3.13b 23.68±5.29b 10.28±1.12a 29.90±1.77b 28.16±2.09b 32.11±5.89b GSH-Px/（U/mgprot）肝臟124.40±4.26b50.20±14.20a71.19±2.58a141.47±3.87b145.13±4.01b189.85±15.49c腦 127.64±14.71bc 59.56±12.03a 88.87±8.02ab 118.18±6.69bc 135.20±7.74bc 156.95±29.42d全血 119.26±12.17b 90.98±3.48b 61.48±10.43a 110.66±10.43b 116.80±5.22b 148.77±5.22c MDA/（nmol/mgprot）肝臟11.48±2.67b18.50±1.00c10.45±1.21b8.57±0.48b7.37±0.73b2.06±0.00a腦 12.95±3.26ab 21.12±2.26b 21.47±3.76b 11.53±4.27a 6.74±1.00a 4.97±0.00a全血 15.38±2.18a 24.62±2.18ab 27.69±4.35c 21.54±2.18ab 18.46±2.18a 17.69±1.09a

2.2 壇紫菜多糖PPⅣ對衰老模型組小鼠的影響

給小鼠連續(xù)皮下注射D-半乳糖8 周后，壇紫菜多糖PPⅣ對衰老模型組小鼠抗氧化活性的影響，如表8所示。與正常對照相比，模型組實驗小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px 活性和腦組織中CAT 活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著增加。與模型組小鼠相比，壇紫菜多糖PPⅣ低劑量組、中劑量組、高劑量組肝臟組織和腦組織中SOD 活性顯著升高，且隨著劑量的增加，呈現(xiàn)一定的量效關系；高劑量組肝臟、腦組織和血液中CAT含量顯著提高；中劑量組和高劑量組肝臟組織、腦組織、血液中SOD 活性顯著升高，MDA 含量顯著下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高劑量組各抗氧化活性指標與VE組活性相當，具有較好的抗氧化活性。

表8 PPⅣ對衰老模型組小鼠SOD、CAT、GSH-Px和MDA的影響（±s，n=10）Table 8 Effects of PPⅣon SOD，CAT，GSH-Px and MDA in tested organs in agedmice（±s，n=10）

表8 PPⅣ對衰老模型組小鼠SOD、CAT、GSH-Px和MDA的影響（±s，n=10）Table 8 Effects of PPⅣon SOD，CAT，GSH-Px and MDA in tested organs in agedmice（±s，n=10）

注：同一行中不同組別間標以不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

參數(shù) 項目 正常組 模型組 PPⅣ低劑量組 PPⅣ中劑量組 PPⅣ高劑量組 VE 組SOD/（U/mgprot）肝臟47.03±0.11b36.14±0.69a49.39±0.57b48.92±1.24c49.32±0.48d57.64±1.43c腦 48.03±2.08b 37.83±1.80a 49.47±0.90b 60.13±3.64c 76.90±3.74d 65.17±5.29c全血 22.96±1.80ab 18.61±0.06a 26.56±0.55ab 41.71±5.00c 46.96±2.12d 43.69±6.41d CAT/（U/mgprot）肝臟60.56±4.27b42.75±2.70a46.07±6.26a68.40±3.70bc94.05±0.28c79.77±3.84c腦 32.61±3.98a 28.65±0.74a 34.38±6.78a 26.57±3.68a 49.70±4.57b 30.63±1.47a全血 28.05±3.13bc 23.68±5.29abc 13.76±0.07a 19.00±1.04ab 35.64±0.89d 32.11±5.89d GSH-Px/（U/mgprot）肝臟124.40±4.26c50.20±14.20a91.27±7.74b140.56±12.91c193.50±10.70d189.85±15.49d腦 127.64±14.71bc 59.56±12.03a 93.60±6.69ab 171.13±6.69c 177.75±9.04c 156.95±29.42c全血 119.26±12.17b 90.98±3.48a 93.60±12.17a 151.23±5.22c 152.46±10.43c 148.77±5.22c MDA/（nmol/mgprot）肝臟11.48±2.67c18.50±1.45d9.94±0.48c6.51±0.48b3.60±0.73ab2.06±0.00a腦 12.95±3.26b 21.12±2.26c 12.60±0.25b 8.34±1.25ab 4.79±1.76a 4.97±0.00a全血 15.38±2.18ab 24.62±2.18bc 28.46±5.44d 19.00±0.76b 9.23±2.18a 17.69±1.09b

2.3 劑量相同時多糖抗氧化活性的比較

2.3.1 低劑量時抗氧化活性的比較

低劑量時各組實驗小鼠肝臟組織、腦組織和血液中 GSH-Px 活性、CAT 活性、SOD 活性及 MDA 含量如圖1所示。

圖1 PPⅡ和PPⅣ低劑量組抗氧化活性的比較Fig.1 The antioxidant effect of PPⅡand PPⅣat low dosage

與衰老模型組相比，壇紫菜多糖PPⅡ和PPⅣ低劑量組肝臟組織中GSH-Px、SOD 活性顯著升高（P＜0.05），MDA 含量顯著下降，PPⅡ和PPⅣ低劑量組兩組相比，各組織中大部分抗氧化指標均不具有統(tǒng)計學意義上的差異。

2.3.2 中劑量時抗氧化活性的比較

PPⅡ和PPⅣ中劑量組抗氧化活性的比較見圖2。

從圖2可以看出與衰老模型組相比，壇紫菜多糖PPⅡ和PPⅣ中劑量組肝臟組織、腦組織中GSH-Px、SOD 活性顯著升高，MDA 含量顯著下降，肝臟組織CAT 含量顯著升高；在相同劑量下，PPⅣ中劑量組腦組織和血液中 GSH-Px、SOD 含量顯著增加，CAT 和MDA 含量無顯著性差異。可見，在中劑量組，PPⅣ組抗氧化活性較高，抗氧化能力顯著優(yōu)于PPⅡ組。

2.3.3 高劑量時抗氧化活性的比較

高劑量時，PPⅡ和PPⅣ組的各項抗氧化指標如圖3所示。

與衰老模型組相比，肝臟組織、腦組織和血液中GSH-Px、CAT、SOD 活性均均顯著增加，MDA 含量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PPⅣ高劑量組和PPⅡ高劑量組相比，肝臟組織中GSH-Px 活性顯著升高、MDA 含量顯著下降；腦組織中GSH-Px、CAT、SOD 活性均顯著高于PPⅡ組；血液中GSH-Px、CAT、SOD 活性均顯著高于PPⅡ組，MDA 含量顯著低于PPⅡ組，且具有統(tǒng)計學意義上的差異，綜上所述，PPⅣ組各項抗氧化指標優(yōu)于PPⅡ，顯示出較好的抗氧化能力。

圖3 PPⅡ和PPⅣ高劑量組抗氧化活性的比較Fig.3 The antioxidant effect of PPⅡand PPⅣat high dosage

3 結論與討論

近年來，抗氧化活性是多糖的研究熱點之一；自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的一類有害化合物[11]，一定情況下會對機體的組織和細胞造成損傷，進而引起慢性疾病及衰老效應[12]。天然多糖作為一種具有抗氧化活性的物質(zhì)，與化學合成抗氧化劑相比，具有無毒、生物相容性好等優(yōu)點[13]。

SOD、GSH-Px、CAT 是生物體內(nèi)幾種重要的抗氧化酶，可以有效清除氧自由基，保護生物體細胞避免氧化損傷；MDA 是生物膜脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物，是反映過氧化損傷的常用指標。抗氧化劑可以提高體內(nèi)抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）的活性，清除體內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化物，從而有效減輕自由基引起機體產(chǎn)生癌變、衰老和慢性疾病，增強機體免疫能力，延緩衰老[14]。

張全斌等通過建立衰老模型動物試驗，研究壇紫菜多糖的抗氧化能力，結果表明，壇紫菜多糖F1 具有良好的清除自由基的作用，能夠明顯提高實驗小鼠組織內(nèi)SOD 活性和GSH-Px 的活性。

本研究采用超濾法將壇紫菜粗多糖進行分離，通過4 種不同截留分子量的超濾膜得到5 種不同分子量的多糖：PPⅠ、PPⅡ、PPⅢ、PPⅣ和 PPⅤ，前期實驗結果表明壇紫菜多糖PPⅡ和PPⅣ對自由基清除能力較強，故本研究主要探討這兩種多糖的體內(nèi)抗氧化活性。實驗結果表明，衰老模型組小鼠在連續(xù)注射D-半乳糖60 d 后，肝臟組織、腦組織和血液中SOD、GSHPx、CAT 活性均顯著下降，MDA 含量顯著升高，說明本實驗中的衰老模型建立成功。PPⅡ和PPⅣ的中劑量組和高劑量均組能不同程度顯著提高肝臟組織、腦組織和血液中SOD 活力、GSH-Px 活力和CAT 活力，顯著降低MDA 含量，表現(xiàn)出較好的抗氧化作用，但是PPⅣ組大部分抗氧化指標明顯優(yōu)于PPⅡ，壇紫菜多糖抗氧化機制及量效關系還有待進一步研究。