燈盞細辛中多酚化合物的提取及體外抗氧化活性研究

朱靜靜，羅霞，趙存朝，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

燈盞細辛（Erigeron breviscapus），別名燈盞花，屬菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，原系云南民間苗族、彝族、德昂族等少數(shù)民族習用草藥[1]，云南省能入藥的燈盞花資源占全國資源總量的95%以上，成為云南省內(nèi)天然藥材的主要資源，在云南省分布很廣，文山、大理、麗江、迪慶、紅河等地州都有生長[2]，燈盞細辛在藥物方面的研究應用較廣，但在食品中的應用卻鮮見報道。

本試驗采用超聲波輔助有機溶劑提取燈盞細辛多酚，在單因素試驗之后，進行響應面優(yōu)化試驗，篩選最佳提取工藝，并進行體外抗氧化活性分析，為燈盞細辛在食品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燈盞細辛：云南省大理州劍川縣金華鎮(zhèn)河東村燈盞細辛種植戶；沒食子酸：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；DPPH、H2O2、ABTS：上海晶純生化科技股份有限公司；福林酚試劑：sigma 公司。

1.2 主要儀器與設備

超聲波清洗機（Scientz-500）：寧波新芝生物科技有限公司；離心機（TDL-5-A）：上海安亭科學儀器廠；數(shù)字型pH 計（pHS-3E）：上海精密科學儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市城西麗華實驗儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器公司；分光光度計（URA14M0018）：上海翱藝儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 燈盞細辛多酚提取方法

準確稱取1 g 燈盞細辛粉末，加入提取溶劑，超聲輔助提取之后離心，取上清液于35 ℃下濃縮后定容至50 mL，測定多酚含量。

1.3.2 多酚含量的測定

利用沒食子酸溶液濃度和吸光度制作標準曲線，建立回歸方程為 Y=0.009 3x+0.102 7（10 μg/mL～60 μg/mL，R2=0.999），式中：Y 為吸光度，x 為沒食子酸濃度（μg/mL），多酚含量以每克燈盞細辛樣品中沒食子酸當量（μg）表示。

多酚含量采用Folin-Ciocalteau 法進行測定，參照參考文獻[3]中方法，略作修改，具體步驟如下：吸取多酚粗提液0.5 mL，加入Folin-Ciocalteau 試劑，充分振搖，加入飽和碳酸鈉溶液和蒸餾水，充分混勻。25 ℃下避光反應離心，用乙醇代替多酚粗提液作為調(diào)零，在725 nm 波長處測定吸光度。

1.3.3 單因素試驗

分別研究不同提取溶劑（70%丙酮、70%乙醇、1%鹽酸-乙醇混合溶液（1.86∶98.14，體積比）、不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、不同超聲時間（5、20、35、50、65 min）和不同提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）下燈盞細辛多酚的提取效果，確定最佳提取工藝。

1.3.4 優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，以燈盞細辛多酚含量為響應值，對料液比（g/mL）、超聲時間（min）、提取溫度（℃）進行響應面Box-Behnken 設計試驗。優(yōu)化燈盞細辛多酚提取工藝條件。響應面分析因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.5 體外抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除率測定[4]

用沒食子酸濃度和DPPH 自由基清除率繪制標準曲線：Y=0.003 4x+0.318 6 （32 μg/mL～192 μg/mL，R2=0.992 5），式中：Y 為 DPPH 自由基清除能力，x 為沒食子酸濃度（μg/mL）。

吸取多酚粗提液，加入31 μg/mL DPPH 溶液，充分振搖后，室溫25 ℃下暗處放置，在517 nm 處測定吸光度，甲醇替代多酚溶液作為空白，甲醇代替DPPH 溶液進行調(diào)零。

式中：A0為空白吸光度，An為樣品吸光度。

1.3.5.2 H2O2清除活性測定

利用沒食子酸測定H2O2清除活性[5]，得到的標準曲線為：Y=0.030 7x-0.003 4（1.28 μg/mL～7.68 μg/mL，R2=0.996 2），式中：Y 為 H2O2清除能力，x 為沒食子酸濃度（μg/mL）。

吸取多酚粗提液，加入40 mmol/L 的H2O2溶液，加入pH 值為7.4、45 mmol/L 磷酸鈉緩沖溶液，反應后，于230 nm 測定吸光度，甲醇替代沒食子酸標準溶液作為空白，磷酸鹽緩沖液代替H2O2溶液進行調(diào)零。

式中：A0為空白吸光度，An為樣品吸光度。

1.3.5.3 羥自由基清除能力測定[6]

利用沒食子酸濃度和·OH 清除率繪制標準曲：Y=0.006 1x+0.046 9 （16 μg/mL～96 μg/mL，R2=0.991 4），式中：Y 為·OH 自由基清除能力，x 為沒食子酸濃度（μg/mL）。

反應體系中加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液，然后加入多酚粗提液，最后加入8.8 mmol/L H2O2啟動反應。空白對照液中加入甲醇替換同體積的沒食子酸標準溶液。37 ℃條件下保溫30 min，以甲醇為參比液，在510 nm 測定吸光值。

式中：A0為空白吸光度，An為樣品吸光度。

1.3.5.4 總抗氧化能力測定

利用沒食子酸濃度和ABTS+自由基清除率繪制標準曲線，Y=0.010 9x+0.057 6（9.6 μg/mL～57.6 μg/mL，R2=0.992 6），式中：Y 為 ABTS+自由基清除能力，x 為沒食子酸濃度（μg/mL）。

吸取多酚粗提液，加入ABTS+自由基稀釋工作液，室溫25 ℃下反應，于734 nm 測定吸光度，甲醇替代沒食子酸標準溶液作為空白，甲醇代替ABTS+自由基稀釋工作液進行調(diào)零。

式中：A0為空白吸光度，An為樣品吸光度。

1.3.5.5 還原能力測定

建立回歸方程為Y=2.375x+0.016 7（0.08 μg/mL～0.48 μg/mL，R2=0.995 3），于 700 nm 下測定。式中：Y 為還原能力，x 為沒食子酸濃度（μg/mL）。

以上自由基清除能力和還原能力表示為每克干燥樣品中沒食子酸當量（μg/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑

不同提取溶劑對燈盞細辛多酚提取的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取溶劑對燈盞細辛多酚提取的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction of Erigeron breviscapus

由圖1可見，燈盞細辛在丙酮、乙醇、鹽酸-乙醇3 種試劑提取條件下，鹽酸-乙醇溶液提取的多酚量明顯高于用丙酮和乙醇溶液提取的。很多關于多酚提取的研究中最佳提取溶劑為70%的乙醇[7-8]，也有研究表明丙酮對花椒多酚的提取效果最佳[9]。本試驗結(jié)果顯示選取1%鹽酸-乙醇作為提取溶劑提取效果最佳，符合pH 值低時，以分子狀態(tài)存在的多酚較多[10]這一說法。

2.1.2 料液比

不同料液比對燈盞細辛多酚提取的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同料液比對燈盞細辛多酚提取的影響Fig.2 The effects of different materials liquid on extraction of Erigeron breviscapus

如圖2所示，隨著料液比增大，多酚提取率逐漸上升，當達到1∶30（g/mL）后提取率開始緩慢下降，后又出現(xiàn)上升現(xiàn)象，從節(jié)約溶劑的角度考慮，料液比選擇1∶30（g/mL）。

2.1.3 超聲時間

不同超聲時間對燈盞細辛多酚提取的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同超聲時間燈盞細辛多酚得率的影響Fig.3 The effects of different ultrasound time on extraction of Erigeron breviscapus

由圖3看出，燈盞細辛多酚的最佳超聲時間是35 min，從理論上看，超聲時間越長對酚類的提取就越充分，但是長時間超聲振動導致多酚結(jié)構(gòu)破壞，超聲時間的延長增加了試驗周期及能耗[11]，綜合考慮，選擇35 min 為最佳超聲時間。

2.1.4 提取溫度

不同提取溫度對燈盞細辛多酚提取的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同提取溫度燈盞細辛多酚得率的影響Fig.4 The effects of different temperature on extraction of Erigeron breviscapus

由圖4可以看出燈盞細辛多酚的提取率隨著溫度的升高先增大后減小，當溫度為60 ℃時提取率最大。可能是高溫造成酚類物質(zhì)的氧化而損失，從而造成總酚的提取率減少[12]，此外在高溫條件下也會導致乙醇揮發(fā)，使液料比改變，從而影響多酚的提取率[13]。

綜上可知，燈盞細辛多酚的單因素提取條件是：1 %鹽酸-乙醇作為提取溶劑、料液比 1∶30（g/mL）、超聲時間35 min、提取溫度60 ℃。

2.2 多酚提取的響應面優(yōu)化工藝

在單因素試驗的基礎上，用1%鹽酸-乙醇為提取溶劑，以A 料液比、B 提取溫度、C 超聲時間為試驗因素，進行響應面試驗，優(yōu)化燈盞細辛中多酚化合物的提取工藝[14]，試驗設計及結(jié)果見表2。

表2 響應面分析方案及結(jié)果Table 2 Response surface analysis program and results

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2進行多元回歸擬合，得到燈盞細辛中多酚含量對料液比（A）、提取溫度（B）、超聲時間（C）的回歸模型方差分析表。模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of the developed quadratic regression model

得到多酚含量對料液比（A）、超聲時間（B）、提取溫度（C）的回歸模型方程為：

從方差分析可以看出，回歸模型F=75.59，P＜0.000 1，說明二次多元回歸模型極顯著；失擬項F=5.926，P=0.0592，模型失擬不顯著；說明模型擬合程度比較好。根據(jù)F 值可知，各個因素對燈盞細辛多酚提取率影響的大小順序為：超聲時間（C）＞料液比（A）＞提取溫度（B）。

2.2.2 響應面優(yōu)化

2.2.2.1 響應面優(yōu)化顯著性分析

通過觀察圖5中響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映料液比（A）、提取溫度（B）、超聲時間（C）之間交互作用對燈盞細辛多酚提取量的影響。結(jié)果見圖5。

圖5 各因素交互作用對多酚提取量影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response of each factor to the effect of polyphenol extraction on the response surface and contour map

由圖5a 可知，提取溫度和料液比對燈盞細辛多酚提取量影響均較顯著，與方差分析結(jié)果相符。由圖5b可知，超聲時間對多酚提取量的影響更顯著一些。由圖5c 可知，提取溫度比超聲時間的變化曲面平緩一些，說明超聲時間較提取溫度對多酚提取量的影響顯著，與方差分析結(jié)果相符。當?shù)雀呔€呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬蹄形時則表示兩因素交互作用顯著[15-16]。

2.2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

響應面驗證性試驗結(jié)果如表4。

表4 響應面驗證性試驗表Table 4 Test table of response surface verification

由表4可知，通過響應面法得到超聲波輔助提取燈盞細辛多酚最佳工藝條件為A 料液比1∶30（g/mL）、B 提取溫度53.25 ℃、C 超聲時間50 min，在此條件下預測得到的多酚含量為11.34 mg/g。實際操作中稍作調(diào)整確定的最佳工藝條件為料液比1∶30（g/mL）、提取溫度50 ℃、超聲時間50 min，在此條件下進行驗證試驗，得到的多酚含量為11.01 mg/g，與理論值很接近，可信度較高。

2.3 燈盞細辛多酚體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基、H2O2和 ABTS+自由基的清除能力

燈盞細辛多酚對DPPH 自由基、H2O2和ABTS+自由基的清除能力結(jié)果見圖6。

圖6 抗氧化活性比較Fig.6 Comparison of antioxidant activity

由圖6可以看出，燈盞細辛多酚對H2O2、DPPH自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力，且對3 種自由基的清除能力存在一定的差異。通過體外抗氧化能力評價：DPPH 自由基清除能力可達86.45%，H2O2清除活性可達91.52 %，ABTS+自由基清除能力可達91.05%。燈盞細辛多酚的抗氧化活性隨著多酚濃度的升高而不斷增大，說明多酚濃度與抗氧化能力成正相關。

2.3.2 自由基清除能力的穩(wěn)定性比較

燈盞細辛多酚清除能力的穩(wěn)定性比較見圖7。

由圖7看出，DPPH 自由基清除能力隨著時間的延長而不斷升高，而H2O2清除活性與還原能力則隨著時間的延長，期初呈現(xiàn)下降的趨勢，逐漸平緩，說明燈盞細辛多酚的DPPH 自由基、H2O2清除活性以及還原能力很不穩(wěn)定；而燈盞細辛多酚的ABTS+自由基清除能力受時間影響較小，說明燈盞細辛多酚的總抗氧化穩(wěn)定性較好。

圖7 抗氧化穩(wěn)定性比較Fig.7 Comparison of antioxidant stability

3 結(jié)論

利用響應面法對燈盞細辛多酚的提取條件進行優(yōu)化，確定了最佳提取工藝條件為：1%鹽酸-乙醇混合溶液（1.86∶98.14，體積比）、料液比 1∶30（g/mL）、提取溫度50 ℃、超聲時間50 min，在此條件下得到的多酚含量為11.34 mg/g。抗氧化活性試驗表明燈盞細辛多酚具有較強的抗氧化能力，說明燈盞細辛在食品工業(yè)中有一定的研發(fā)價值。