蛋白酶抑制子在植物與病原物互作中的作用*

王長春， 劉真真， 葉 濤， 劉 敏， 韓佳峰， 吳園園， 楊 玲

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

蛋白酶是通過水解肽鍵將蛋白質降解為氨基酸或多肽，不可逆決定蛋白質最終去向的一類酶，對于生物體的生長發育與環境適應性均有著非常重要的作用[1].如何從時空上精確調控蛋白酶的活性，使其在正確的時空中發揮功能，對于植物的生長發育與抗逆性非常關鍵.蛋白酶的水解活性受到PIs的嚴格調控[2]，研究表明，PIs在植物抗病性、免疫應答[3]與細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)[4]等生理過程中發揮著極其重要的作用.

1 PIs的特征及分類

PIs是一類能與蛋白酶產生特殊相互作用以抑制蛋白酶活性的多肽和蛋白質，普遍存在于動植物及微生物體內.它的基本特點是分子量較低，通常由30個以上氨基酸組成，個別較大的可達到400多個氨基酸[5]；分子內半胱氨酸含量相對較高，一般不含有內含子[6].PIs能與相應的蛋白水解酶在生物體內形成動態平衡[7]，它們的具體作用方式是通過“位阻”來抑制底物與蛋白酶活性位點結合[2,8-9].在植物中，PIs可作為植物貯藏蛋白存在于塊莖、種子、果實等器官中[10]，特別是種子中含量豐富，高達總蛋白的10%[11].

根據對底物蛋白酶的抑制特性，Laskowski等[12]將蛋白質類PIs系統地分為4大類：絲氨酸蛋白酶抑制子(serine proteinase inhibitor)、半胱氨酸蛋白酶抑制子(cysteine proteinase inhibitor)、金屬蛋白酶抑制子(metalloproteinase inhibitor)和酸性蛋白酶抑制子(acid proteinase inhibitor).目前研究較多的是絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制子，其中絲氨酸蛋白酶抑制子已經發現1 500余個成員[13].隨后，Rawlings等[14]根據PIs的功能結構域氨基酸序列的同源性和折疊特點，將PIs分為48個家族；隨著更多基因組測序的完成，在最新的分類系統中，PIs被分為83個家族[15](http:/www.ebi.ac.uk/merops/).

2 PIs在植物與病原物互作中的作用

在植物與病原物的互作過程中，病原微生物分泌大量的效應子來增強致病性，這些效應蛋白就包括降解植物抗病相關蛋白的蛋白酶和抑制植物蛋白酶的PIs.相反，植物自身也會分泌蛋白酶和PIs來應答病原物蛋白酶和PIs，誘發防御反應，進而提高對病原物的抗性，這是在植物與病原物互作中重要的防御或進攻手段，其互作過程相對復雜，涉及到不同信號通路的激活.因此，PIs是植物抗病性的主要系統之一，在植物與病原物的互作中起著重要的作用.

2.1 植物PIs在植物與病原體互作中的作用

2.1.1 PIs能夠抑制病原物的生長

PIs作為植物體本身存在的病程相關蛋白，當植物受到病原物侵襲時所表現出最為普遍的防御反應就是激活自身PIs基因來提高自身抗病能力[16]，隨著被侵染部位致病癥狀的出現，植物體會產生更多的PIs.植物PIs通過抑制病原體蛋白酶或調節內源性植物蛋白酶抑制病原物，但具體作用機制不詳.超表達水稻半胱氨酸蛋白酶抑制子的煙草植株表現出對煙草蝕刻病毒(Tobaccoetchvirus，TEV)與馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)的抗性顯著增強[17-18].花生中胰蛋白酶抑制子經純化后可顯著抑制黃曲霉(Aspergillusflavus)孢子的萌發和菌絲的生長[19].從蒺藜苜蓿中分離出一種名為蛋白酶抑制子I4(MtPiI4)的基因，超表達MtPiI4轉基因擬南芥植株表現出對丁香假單胞菌番茄致病菌更強的抗性[20].在疫霉侵染時，馬鈴薯葉片會誘導產生絲氨酸蛋白酶抑制子PLPKI，該抑制子特異性抑制致病疫霉(Phytophthorainfestans)與立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)分泌的胞外蛋白酶，PLPKI的表達量與馬鈴薯對疫霉的水平抗性強弱成正相關，表明馬鈴薯可能通過分泌PLPKI來免受卵菌的侵染[21].從巴西橡膠樹中分離了一種蛋白酶抑制子，可以增強對紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)的抗性[22].從黃秋葵種子中分離的一種凝集素，具有胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶抑制子活性，對根結線蟲具有直接的毒性[23].這些研究結果表明，植物PIs可能是通過抑制病原物蛋白酶活性使得病原物得不到充足的氨基酸進而使生長增殖受阻，從而提高抗病性.

2.1.2 PIs在植物信號轉導中的作用

在玉米與瘤黑粉(Ustilagomaydis)的互作中，內源水楊酸誘導半胱氨酸蛋白酶在提高對瘤黑粉病的抗性中起著重要作用.這些蛋白酶的表達可以被過表達半胱氨酸蛋白酶抑制子CC9抑制.瘤黑粉菌利用這一特點，在侵染玉米時，通過分泌效應子pep1誘導CC9表達以抑制玉米的防御反應，CC9是蛋白酶抑制子，它的功能主要是抑制蛋白酶的活性.在該研究中,CC9除具有抑制與抗病相關的蛋白酶活性功能外，還具有抑制這些蛋白酶表達的功能[3].說明蛋白酶抑制子是抗病信號中的重要組分.由于尚未鑒定到與CC9直接互作的蛋白，因此無法確認是CC9抑制蛋白酶活性反饋抑制了蛋白酶基因的表達還是CC9與其他蛋白互作抑制蛋白酶的表達.一種Kunitz型胰蛋白酶抑制子LeMir(LycopersiconesculentumMiraculin)在番茄抗葉霉菌基因介導的過敏性壞死(hypersensitive response，HR)產生的Peronospora tabacina Adam前后表達量具有顯著差異.超表達LeMir的植株顯著誘導Cf介導的HR的產生；而在沉默LeMir后的番茄植株上Cf介導的HR明顯減弱[24].由于該研究未涉及病原物，推測LeMir可能參與Cf基因介導的HR信號轉導過程.

2.1.3 植物PIs參與調控細胞程序性死亡

細胞程序性死亡也是植物中PIs調控的生理過程之一[25-26].煙草中的一種新型半胱氨酸蛋白酶抑制子基因NtCYS對胚細胞的程序性死亡具有重要的調控作用[27].有研究發現[4]，在敲除擬南芥中的一種Kunitz蛋白酶抑制子基因Atwscp(與擬南芥花粉發育相關的十字花科水溶性葉綠素蛋白)的突變體中，出現花粉早熟并產生細胞死亡現象，且胚珠受精、胚胎發育和種子形成均受到不同程度的影響.說明Kunitz蛋白酶抑制子Atwscp基因在花粉管的PCD中起著重要的調控作用.定位于辣椒中質膜的半胱氨酸蛋白酶抑制子CaPR4c參與植物細胞PCD的調控過程[28]，野油菜黃單胞桿菌(Xanthomonascampestris)Ⅲ型效應子AvrBsT觸發程序性細胞死亡并激活植物的HR.AvrBsT可以快速和特異性誘導CaPR4c表達，而CaPR4c的瞬時表達導致辣椒葉片細胞出現HR，并伴隨著一些防御反應基因表達量升高.CaPR4c沉默的辣椒中PCD的誘導和防衛反應基因表達均明顯降低.因此,認為AvrBsT通過特異性誘導CaPR4c的表達而導致HR的產生；超表達CaPR4c的擬南芥對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)抗性顯著增強.ATMC1是半胱氨酸蛋白酶抑制子，該基因在擬南芥或其他植物中過量表達會導致過敏性壞死[29].因此,ATMC1的表達量必須被精確調控.ATMC1在擬南芥中有2種存在形式：無N端的前導肽的剪切型和非剪切型，剪切型具有更強的促壞死活性.擬南芥絲氨酸蛋白酶抑制子AtSerpin1可以與非剪切型的ATMC1互作，不僅抑制ATMC1自我剪切，而且抑制了依賴于ATMC1介導的HR[30].上述研究結果表明，蛋白酶抑制子在植物發育和抗病性PCD中具有重要的作用，所不同的是有的是正向調控PCD，有的是負向調控PCD，說明PIs功能復雜，需逐個深入研究.

2.2 病原體PIs在植物與病原體互作中的作用

2.2.1 病原體PIs增強宿主的致病性

為了增強宿主的致病性，病原物在侵染植物的過程中也會分泌大量的效應子,這些效應子包括降解植物抗菌蛋白的蛋白酶和抑制植物蛋白酶具有抗菌活性的PIs[31]，調控宿主防御系統來增強致病性.已有諸多研究證明，來自病原體的PIs具有抑制不同的宿主蛋白酶的功能.葉霉菌(Cladosporiumfulvum)侵染番茄時分泌的效應子Avr2是一種半胱氨酸蛋白酶抑制子，體外活性檢測證明Avr2抑制番茄質外體木瓜絲氨酸蛋白酶PLCPs (papain-like cysteine proteases)類的Rcr3和Pip1.Rcr3是番茄中的半胱氨酸蛋白酶，對于Avr2介導的HR是必須的.Rcr3蛋白活性喪失特異性地降低了對番茄葉霉菌的抗性.Avr2可以抑制Rcr3蛋白酶活性，增強了葉霉菌對番茄的致病性.超表達Avr2的番茄植株對其他致病真菌包括灰霉病菌(Botrytiscinerea)和黃萎病菌(Verticilliumdahliae)的敏感程度顯著增強，這說明Avr2還可能通過抑制宿主中的其他蛋白酶來降低植物的抗病性[32].EPIC1和EPIC2B是致病疫霉侵染番茄時分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制子，它們可以與Rcr3發生物理性互作抑制其半胱氨酸蛋白酶活性，Rcr3的突變降低了對致病疫霉的抗性[33].類枯草桿菌蛋白酶的絲氨酸蛋白酶P69B是病程相關蛋白，它的表達受多種病原物誘導.由致病疫霉(Phytophthorainfestans)分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶抑制子EPI1(extracellular proteinase inhibitor 1)含有2個與Kazal族的絲氨酸蛋白酶抑制子高度同源的功能域.EPI1不僅特異性地抑制枯草桿菌蛋白酶A活性，而且還能與P69B互作抑制絲氨酸蛋白酶活性.與EPI1結構類似的EPI10也同樣可以與P69B發生特異性互作，抑制枯草桿菌蛋白酶活性.由玉米瘤黑粉菌分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制子Pit2對與玉米防御病原體密切相關的3種半胱氨酸蛋白酶(CP2,CP1A和CP1B)表現出顯著的抑制作用[34].上述研究表明，由不同類型的真菌和卵菌病原體分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制子和絲氨酸蛋白酶抑制子均在不同程度上對抑制宿主防御系統或增強自身致病性起著至關重要的作用.

2.2.2 病原體PIs提高宿主的抗病性

Silva等[35]發現煙霜霉病菌(PeronosporatabacinaAdam)絲氨酸蛋白酶抑制子基因NmIMSP(N. megalosiphon inhibitor of microbial serine proteinase gene)在煙草中瞬時表達會表現出對霜霉病較高的抗性，而沉默NmIMSP的植株對霜霉病抗性明顯變小，這是微生物絲氨酸蛋白酶抑制子作為抑制卵菌生長的首個證據.

3 總結與展望

綜上所述，PIs在植物的基礎抗性及程序性細胞死亡信號轉導過程中均發揮著重要作用.目前在植物或病原物中分析鑒定了較多的蛋白酶，且一部分蛋白酶在植物的抗/感病中的功能有了較為深入的研究.雖然在植物與病原物的基因組中同樣有較多的蛋白酶抑制子基因，有關它們的功能研究明顯滯后于蛋白酶.因此分析鑒定特異性靶蛋白酶抑制子是今后可能的重要研究領域；其次,由于蛋白酶抑制子與蛋白酶具有較強的親和性，因此，通過重要的蛋白酶為誘餌，采用多種分子生物學手段，鑒定與蛋白酶直接互作的PIs，可以更有目的性地鑒定調控靶蛋白酶活性的PIs.